[发明专利]一种寡核苷酸基因芯片及其在检测多种病菌方面的应用

权利要求书

1.一种应用于检测样本中多种病菌的寡核苷酸芯片，包括基底和固定于该基底上的探针，其特征在于所述探针可分别与结核分枝杆菌（M．tuberculosis）、牛分枝杆菌（M. bovis）、鸟分枝杆菌（M. avium）、副结核分枝杆菌（M. paratuberculosis）和布氏杆菌（Brucella）的PCR扩增产物进行杂交反应；

所述探针是以Genebank上已公布的M．tuberculosis H37Rv、M. bovis AN5、M. avium、M. paratuberculosis和Brucella五种细菌的基因序列，分别选择M．tuberculosis H37Rv的mpt40基因、M. bovis AN5的pncA基因、M. avian的gyrB基因、M. paratuberculosis的IS-900基因、Brucella的Alkb基因序列为参考序列，设计引物，筛选得到；

所述引物分别具有SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4 ；SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10；SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12；SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18；SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24所示的核苷酸序列；

所述探针分别具有SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：31 、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：39所示的核苷酸序列；

上述引物中所有下游引物在5’端进行Cy3标记；所述探针在3’端进行氨基修饰。

2.一种权利要求1所述基因芯片在检测多种病菌方面的应用，其特征在于包括以下步骤：

（1）应用权利要求1所述的引物和探针，将探针点样至基因基片上；

（2）基因基片上的探针与待测病菌菌株的PCR扩增产物进行杂交反应；所述待测病菌为结核分枝杆菌（M．tuberculosis）、牛分枝杆菌（M. bovis）、鸟分枝杆菌（M. avium）、副结核分枝杆菌（M. paratuberculosis）和布氏杆菌（Brucella）；

（3）杂交反应后将洗涤干燥后芯片经扫描仪扫描获取杂交信号。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于步骤（2）所述PCR扩增为五重PCR不对称反应体系，扩增条件为：

所述结核分枝杆菌（M．tuberculosis）、牛分枝杆菌（M. bovis）、鸟分枝杆菌（M. avium）、副结核分枝杆菌（M. paratuberculosis）和布氏杆菌（Brucella）引物的荧光引物与非荧光引物的最适浓度比例分别为10：1、8：1、10：1、10：1、10：1；终浓度分别为1.0μM/0.1μM、1.0μM/0.125μM、0.75μM/0.075μM、2.0μM/0.2μM、1.0μM/0.1μM；DNA聚合酶的用量为1.0U；Mg²⁺浓度为3.0mM/L；PCR退火温度56℃。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于步骤（2）所述杂交反应的条件为：杂交温度为42℃，杂交时间为60min。