[发明专利]一株H9N2禽流感病毒疫苗株及其在免疫保护上的应用

说明书

技术领域

本发明涉及动物病毒学领域，本发明提供了一株H9N2禽流感病毒疫苗株，其实际上为一株自然重组的鸡源H9N2禽流感病毒毒株，且提供了该疫苗株的筛选过程及其在免疫保护特别是制成灭火疫苗后在SPF鸡上的免疫效果分析。 

背景技术

禽流感病毒(AIV)隶属于正粘病毒科A型流感病毒属，基因组分为8个节段。核酸总长度约为13.6kb，编码至少11个病毒蛋白。由于AIV负链、分节段的RNA病毒性质，病毒很容易发生变异并不断的突破其感染宿主的种属障碍，引起新的流感流行。AIV据其致病性可分为高致病性AIV(Highly Pathogenic Avian Influenza virus，HPAlV)和低致病性AIV(Low Pathogenic Avian Influenza virus，LPAIV)，感染家禽的HPAIV和LPAIV分别以H5和H9亚型为主。 

H9N2亚型流感属于低致病性流感病毒，但它的危害却不容忽视。H9N2AIV在世界范围内广泛存在，在北美，H9N2AIV主要存在于海鸟和野鸭体内(Kawaoka et al.1988；Sharp et al.1993)。1966年，H9N2AIV开始在美国火鸡群中广泛暴发流行(Homme et al.1970)，1981至1996年美国连续爆发过16次H9N2AIV感染火鸡群事件(Alexander 2000)。 

1994年，陈伯伦等在广东省某鸡场分离到6株H9N2亚型AIV(陈伯伦et al.1994)，将这些病毒实验室接种鸡，表现为典型的临床症状，但不引起鸡死亡。这次AI发生之后，H9N2 AIV在我国一直呈上升趋势，严重制约了养禽业的发展，同时，众多的人和猪暴露于H9N2 AIV中，也增加了人和猪感染H9N2 AIV的可能性。 

近年来，随着我国养殖业飞速发展，我国成为养殖大国，但还不是养殖强国。H9N2亚型是目前我国鸡群中存在的AIV的主要亚型，占禽流感总发病率90％以上。H9N2亚型禽流感发病后虽然致死率不高(一般不超过30％)，但常导致呼吸道症状，蛋鸡的产蛋下降，并使鸡群易继发严重的呼吸道疾病，影响家禽生产性能；肉鸡感染后造成免疫抑制，容易造成继发感染和混合感染，从而给肉鸡养殖业造成巨大经济损失。我国在禽流感的防控中采取了疫苗免疫和扑杀的政策，实践证明该政策对控制禽流感的大规模流行起到了重要作用。积极开展流行病学调查，密切追踪AIV的分子进化和抗原变异，选择免疫保护性好的H9N2流感病毒疫苗株，才能保证疫苗良好的免疫效果。 

众所周知，禽流感病毒变异非常快，因此及时的发现新的毒株研究其特性，并最终筛选出可以作为疫苗株的毒株是保证禽流感疫苗效果的最重要方式之一。 

发明内容

本发明的发明人提供了一株H9N2禽流感病毒疫苗株，其实际上是一株自然重组的A/Chicken/Shangong/SG2/2009(简称CK/SD/SG2/2009)(H9N2)禽流感病毒毒株，并提供了该毒株的全基因组序列，阐明其8个基因片段与国内经典的H9N2病毒株在系统进化上的差异，从而为H9N2病毒的分子进化和流行病学研究提供资料；同时提供了该毒株作为疫苗株的试验数据和指标，以明确其作为H9N2流感疫苗备用毒株的可行性。 

发明人对该毒株进行了生物保藏，其保藏编号为：CCTCC NO：V201030。 

该病毒的全基因组序列测定表明，其PB2基因隶属于CK-SH-Y-2008-like谱系，其它七个基因属于CK-SH-F-98-like谱系，进而这是一株重组H9N2禽流感病毒毒株。 

针对该病毒遗传背景，发明人采用的分离及鉴定方法如下： 

病毒分离鉴定： 

取发病鸡的内脏器官(肝、肾、脾等)加入适量的灭菌生理盐水研磨成匀浆，8000转/分钟(rpm)离心8分钟，吸取上清。然后加入青霉素和链霉素4℃处理1小时后，取上清经尿囊腔接种9-10日龄的SPF鸡胚，0.2ml/枚，置孵化器中培养。每天观察两次，弃除24小时内的污染胚，收取死亡胚的尿囊液。通过血凝试验检测尿囊液有无血凝性，收集有血凝性尿囊液，通过血凝抑制试验(HI)和PCR方法鉴定为H9N2亚型禽流感。血凝抑制试验用到的H5、H9、新城疫(ND)标准抗体购自哈尔滨兽医研究所。 

纯化： 

把鉴定好的病毒在9-10日龄SPF鸡胚上连续传三代纯化病毒，无菌收集尿囊液并且分装在冻存管中在-70℃冰箱保存备用。