[发明专利]重组犬α干扰素的优化基因、菌种及高效表达

说明书

技术领域

本发明涉及一种优化的重组犬α干扰素基因及表达菌种，属于基因工程生物制药领域。

背景技术

犬类动物作为伴侣动物、警犬、救护犬等在人类的生活中占据日益重要的地位，与之相伴的犬类各种病毒性疾病也在人们的生活中重复发生，有些成为人畜共患病的病原，引起全社会的关注。但在兽医临床方面，目前还没有一种治疗病毒性疾病的特效药。

1957年，英国科学家Alick Isaacs和Iean Lindenmann首次发现一种能够干扰病毒繁殖的物质，称之为干扰素（interferon, IFN），从此开始了干扰素的研究工作。

1987年，Himmler等首先开始了犬干扰素α（CaINF-α）的研究工作，报道了CaINF-α基因序列（GenBank M28624.1  GI:163973）[Himmler A,Hauptmann R,Adolf G R.Structure and expression in Escherichia coli of canine interferon-alpha genes.J Interferon Res.1987.7:173]，并申报了相关专利。我国的科学工作者于上世纪90年代也相续开始了犬干扰素α的研究工作，并在犬干扰素α的基因重组、克隆、表达等方面取得了一系列的研究结果。其中，夏春等[夏春，汪明，夏兆飞.拉布拉犬和德国牧羊犬干扰素α基因克隆及测序.农业生物技术学报1999，7（3）]进行了拉布拉多犬和德国牧羊犬干扰素α基因克隆及测序的研究，但没有后续的关于表达、应用等方面的研究报道。王艳等[王艳，王海震，曹瑞兵等.犬α干扰素基因的高效表达及其活性测定.中国病毒学2005，20（2）189－192]对犬干扰素α基因的克隆、表达和活性测定进行了比较系统的研究。

现有技术中，重组犬干扰素α存在表达率不高、比活性低的特点，通常表达量都不会超过30%。王艳等（对比文件1）[王艳，王海震，曹瑞兵等.犬α干扰素基因的高效表达及其活性测定.中国病毒学2005，20（2）189－192]对犬干扰素α基因的克隆、表达和活性测定进行了比较系统的研究，4h时目的蛋白表达量约占菌体的27.6%，纯化后蛋白的比活性仅为5.11×10⁶U/mg，中国专利CN200610041237.X（对比文件2）公开了一种重组犬α干扰素的制备方法，通过构建一优化的大肠杆菌密码子DNA序列，转入表达载体后再转化大肠杆菌，表达所得的重组犬α干扰素的比活仅为10⁵数量级。中国专利CN101798573A（对比文件3）公开了一种全基因犬α干扰素基因及蛋白表达，所得目的蛋白比活相对较高，可以达到1.67×10⁷U/mg。

发明内容

本发明的目的在于提供一条重组犬干扰素α编码基因的大肠杆菌密码子优化DNA分子，或者，在严格条件下，与该序列限定的DNA序列杂交且编码相同功能蛋白的DNA分子。优选地，本发明所述的优化的DNA分子具有与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列至少90%的同源性且编码相同功能蛋白的DNA分子，更优选地，为具有95%、96%、97%、98%、99%同源性或完全一致的DNA分子。

本发明的再一目的在于提供一种含有本发明所述大肠杆菌密码子优化DNA分子的重组载体。

本发明的还一目的在于提供一种含有本发明所述重组载体的重组菌，所述重组菌的宿主菌可以是大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌或酵母菌，优选为大肠埃希氏菌。本发明所述重组大肠埃希氏菌（Escherichia coli）BL21(DE3)/pBV220/Ca IFN-αCGMCC NO.4881。该菌株已于2011年5月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101），保藏号为CGMCC No.4881。保藏期限为30年，分类命名为：大肠埃希氏菌Escherichia  coli。

本发明的还一目的在于提供本发明所述优化DNA分子、含有本发明所述优化DNA分子的表达载体以及含有所述表达载体的大肠杆菌在工业化制备重组犬干扰素α中的运用。本发明所述重组菌表达目的蛋白量高，可以达到40%以上，所得纯化后的目的蛋白抗病毒比活性高，可以达到4×10⁷U/mg。

本发明的还一目的在于提供一种制备犬干扰素α的方法，本发明所述的方法，包括如下步骤：发酵上述所述重组菌，经过破碎提取，复性，纯化得到犬干扰素α。