[发明专利]一种快速提取人参叶组织RNA的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种提取RNA的方法。

背景技术

从植物组织中提取质量高，完整性好的RNA是进行转录组分析、cDNA文库构建、northern印迹分析，DDRT-PCR、cDNA末端快速扩增、RT-PCR等分子生物学研究领域的工作基础。针对不同的植物材料选择适合的方法至关重要。由于人参植物中含有大量的蛋白质、糖、多酚以及其他次生代谢物质代谢产物，内源RNase活性较高，严重干扰了RNA的提取，导致实验失败。以往大多数实验室都采用传统的CTAB法、SDS法提取植物的RNA，或者购买商业试剂盒提取RNA，这些方法操作步骤繁琐，耗时长，所用药品多，成本高。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有提取人参叶组织RNA的方法存在步骤繁琐、耗时长、所用药品多和成本高的问题，而提供一种快速提取人参叶组织RNA的方法。

快速提取人参叶组织RNA的方法按以下步骤进行：一、将200mg人参叶组织，洗净拭干后在液氮中研磨成粉末，然后加入到装有750μL提取缓冲液和75μL β-巯基乙醇的离心管中，再加入350μL Tris平衡酚和350μL氯仿，震荡5min后在13000r/min、4℃的条件下离心5min；二、离心后取上清，加入350μL Tris平衡酚和350μL氯仿，震荡5min后在13000r/min、4℃的条件下离心5min，离心后取上清，加入750μL的氯仿，震荡5min后在13000r/min、4℃的条件下离心5min；三、离心后取上清，加入等体积的异丙醇，混匀后于-20℃沉淀20min，然后在13000r/min、4℃的条件下离心15min，弃去上清液；四、采用体积浓度为75％、冰浴的乙醇1mL洗涤RNA沉淀一次，空气中晾干沉淀，即完成快速提取人参叶组织RNA；

其中步骤一中提取缓冲液：2％(质量)十二烷基硫酸钠、4mol/L尿素、0.1mol/LNaCl、0.01mol/L EDTA(pH8.0)和0.05mol/L Tris-HCL(pH8.0)；步骤一中β-巯基乙醇的体积浓度为10％。

本发明与传统的CTAB法等相比，提取效果比较好，时间短，容易操作。比商业试剂盒提取成本低。

1、提取缓冲液中多种成分的加入可以增加对RNase活性的抑制。SDS不仅是蛋白质变性剂，同时也是RNase的抑制剂，高浓度的尿素也是RNase的抑制剂。

2、在材料提取之前，预先在提取液中加入Tris-平衡酚、氯仿，更能有效的抑制RNase的活性。同时Tris-平衡酚、氯仿震荡抽提，可以充分的变性RNase，通过离心除去。

3、提取液中加入了10％的β-巯基乙醇，高浓度的β-巯基乙醇用来抑制RNA酶的活性，也可以防止样品氧化，因为酚类化合物很容易被氧化形成以共价键连接的奎宁，更易于绑定核酸，这引起了对RNA不可逆转的破坏。β-巯基乙醇作为强还原剂可以防止多酚的氧化，可以打断多酚氧化酶的二硫键使之失活。

4、前3点能很好的解决了RNAase污染的问题。保护RNA不受污染和降解。

5、SDS是阴离子去污剂，可以解离核酸与蛋白质的结合，并且蛋白质与带正电荷的侧链结合，在高盐存在下形成SDS-蛋白质复合物而沉淀。

6、传统的CTAB法需要65℃水浴，在SDS法中无65℃水浴，这样也避免了CTAB法中由于高温而引起RNA降解和水中污染的机会。

7、在所有离心的过程中都选择了高速离心(13000r/min)，高速离心，减少离心时间。提取出来RNA质量也很高。

8、在沉淀过程中，在冰箱-20℃内进行20min沉淀，比传统的室温沉淀、冰上沉淀效果好，比过夜沉淀的方法更减少时间，也减少了其他杂质也被沉淀的机会。可以防止RNA在沉淀过程中不被降解。

9、传统提取RNA的方法大约在150分钟左右，过夜沉淀的方法需要的时间更长。在本方法操作过程中，从提取到最后得到样品需要的时间在90-100分钟之内。节省了时间。

10、本方法比商业试剂盒方法成本低，国外提取试剂盒提取50次/盒，大约要上千元成本，本方法配制提取50次的各种试剂用量需要500-600元的成本。

附图说明

图1为具体实施方式一中总RNA质量检测的琼脂糖凝胶电泳图；图2为具体实施方式一中RT-PCR检测的琼脂糖凝胶电泳图。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。