[发明专利]一种病原丝状真菌特异性启动子及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种丝状真菌特异性启动子及其应用。

背景技术

病原丝状真菌，包括植物病原真菌和昆虫病原真菌，侵染宿主时，首先要形成侵染结构附着胞。附着胞的功能是提供机械压力和分泌水解酶，以形成侵染钉穿透宿主体壁；因此，附着胞的形成对于病原丝状真菌成功侵染宿主至关重要。目前，对病原真菌附着胞形成期间的基因表达已有一些报道，但对附着胞形成和分化过程中的基因调控目前尚无报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种病原丝状真菌的特异性启动子，所述启动子来自于蝗绿僵菌，其能够在病原丝状真菌附着胞形成期特异性表达。

本发明的另一目的在于提供上述启动子在制备高侵染能力的转基因菌株中的应用，其能够驱动同、异源基因在附着胞形成期间高效表达。

本发明病原丝状真菌的特异性启动子PMagas1，来源于蝗绿僵菌(Metarzhizium acridum)Magas1基因的上游序列，可以是下述核苷酸序列之一：

(1)至少含有SEQ ID NO.1所示的DNA序列；

(2)与SEQ ID NO.1所示序列互补的DNA序列；

(3)与SEQ IDNO.1所示序列或其互补序列具有90％或90％以上相似性，且具有相同功能的DNA序列。本领域普通技术人员均知晓因不同启动子之间核苷酸相似性非常低，通常只是其中的一些顺式作用元件具有保守性，改变启动子中某些非重要核苷酸并不会影响启动子的活性，但改变几个核苷酸会导致相似性低于100％、大于等于90％，因此与SEQ ID NO.1所示序列或其互补序列具有90％或90％以上相似性，且具有相同功能的DNA序列也属于本发明的保护范围。

含有上述病原丝状真菌的特异性启动子的重组表达载体、转基因菌株以及该转基因菌株的制备方法等均属于本发明的保护范围。

本发明构建了含有PMagas1启动子驱动外源基因的表达载体，在一个优选的实施方式中，所述的表达载体为PMagas1-EGFP，其具有如图1所示的结构。

本发明含上述病原丝状真菌的特异性启动子的转基因菌株的构建方法，包括以下步骤：

(1)、将PMagas1启动子与目的基因可操作地连接；

(2)、构建含有PMagas1启动子与目的基因的表达载体；

(3)、将所述表达载体转化菌株，得到转基因菌株。

侵染结构附着胞的形成是植物和昆虫病原真菌侵染的前提条件，发明人对蝗绿僵菌基因组的研究中发现，其Magas1基因在附着胞期间大量表达，发明人随后经大量实验研究证明PMagas1启动子在附着胞时期特异性高效表达。本发明启动子为研究病原丝状真菌在附着胞形成及穿透寄主体壁过程的调控，以及野生型昆虫病原菌株基因工程改造提供了重要工具，具有重要很好的应用价值。

附图说明

图1：PMagas1-EGFP表达载体图谱；其中PMagas1：Magas1基因启动子；EGFP：绿色荧光蛋白；TTrpC：构巢曲霉色氨酸合成酶基因终止子；Bar cassette：除草剂抗性元件；Kan：卡那霉素抗性元件；LB和RB为Ti质粒双元载体左右边界。

图2：转化子PCR电泳验证图；M：DNA标准；泳道1-13为13个不同转化子；NC：阴性对照，蝗绿僵菌CQMa102野生型菌株；PC：阳性对照，含bar抗性元件的质粒。

图3：PMagas1-EGFP蝗绿僵菌转化子在各阶段的荧光观察；A：转化子孢子；B：萌发的孢子；C：附着胞；D：菌丝；E：血淋巴中菌丝体；标尺为10μm。

图4：不同生长时期Magas1半定量RT-PCR；1-6分别为孢子、萌发孢子、菌丝、附着胞、体内菌丝及体表孢子总RNA中Magas1表达分析；组成型基因gpd作为内参。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

以下所使用的方法如无特殊说明，均为常规方法；所用材料和试剂等，如无特殊说明，均可从商业得到。

实施例1：启动子的分离