[发明专利]一种基于熵驱动的DNA杂交反应和荧光显微镜计数进行单分子检测的新方法

权利要求书

1.一种基于熵驱动的DNA杂交反应和荧光显微镜计数进行单分子检测的新方法。

步骤包括：

(a)如检测的目标是核酸，根据目标链的序列设计相应序列的H1链和H2链。如果是用核酸适体的特异性结合来检测目标蛋白质或者小的化合物分子。首先设计引发链T，T链包括两个功能部分：一部分是可以和检测目标结合的核酸适体部分，一部分是和H1链互补结合的部分。H1链和H2链有互补部分，但在低于杂交反应的温度条件下，H1链和H2链单独混合，不会自身打开彼此互补并延伸。

(b)在有目标核酸(T)存在的情况下，T链结合H1链并互补，和T链互补后的H1链和H2链互补，H2链再和H1链互补，于是形成一条序列为TH1H2 H1H2 H1H2......的长链(L)。

(c)在H1链和H2链的一端或者两端进行标记，以便于荧光检测。

(d)利用显微镜，如荧光显微镜，荧光共聚焦显微镜进行长链(L)的检测。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(a)中的H1链和H2链，其结构为：一小段单链，互补的双链和单链环(loop)部分。其中一小段单链的序列长度范围为4-18个碱基；单链环(loop)部分序列长度范围为：4-24个碱基。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(b)中形成的长链(L)，无需利用酶等生物学放大手段，而是利用不同碱基互补自由能的不同，通过目标链的引发，利用溶液中的自由能的驱动自发形成一条双链(中间有小部分单链)的长链。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：利用熵驱动，通过目标链的引发，形成溶液中的核酸长链。长链的组成部分，不限于两种核酸，如：H1链和H2链，也可以为多种(3-9种)核酸分子彼此引发。其中一种引发形式为：T引发H1后，H1引发H2链，H2引发H3链，H3再引发H1链，形成T H1 H2 H3 H1 H2 H3 H1 H2 H3......的结构。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(c)中对H1链和H2链的一端或者两端直接进行荧光标记，方便以后的荧光检测。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(c)中对H1链和H2链的一端或者两端进行化合物或者蛋白质的标记，方便以后和荧光物质连接。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(d)中利用显微镜的手段对步骤(b)中形成的长链(L)进行检测和计数。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(d)中利用显微镜的手段对步骤(b)中形成的长链(L)进行检测和计数时，不利用标记的手段，而是利用荧光物质和双链核酸相互作用，如嵌插入双链之间等作用，长链(L)和H1链、H2链荧光强度的不同，实现荧光检测。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(d)中利用显微镜的手段对步骤(b)中形成的长链(L)进行检测时，利用软件进行荧光阈值的判断并进行长链(L)的计数。