[发明专利]一种猪细小病毒灭活疫苗的生产方法

说明书

技术领域 本发明涉及一种猪细小病毒灭活疫苗的生产方法，属于兽用生物制品领域。

背景技术 猪细小病毒(Porcine Parvovirus，PPV)是引起母猪繁殖障碍的主要病原之一。该病的主要特征是怀孕母猪发生流产、死产、胚胎死亡和胎儿木乃伊化，而母猪本身不表现临床症状，其他猪感染后也无明显的临床症状。本病一般呈地方性流行或散发，有时也呈现流行性或称为“暴发”，这种“暴发”多见于猪群初次感染，特别是初产母猪症状明显。目前该病已普遍存在于世界各地的猪群中，给养猪业造成了巨大经济损失。

为了减少猪细小病毒病对养猪业造成的损失，国内外许多学者进行了广泛的研究，在疫苗研制上也取得了一定的进展。国外Paul(Paul PS，Mengeling WL，Evaluation of a modified live-virus vaccine for the prevention of porcine parvovirus induced reproductive disease in swine.Am.J.Vet.Res，1980，41(2)：2007-2011)，Fujisaki(Fujisaki，et.al， Establishment of the attenuated strain of porcine parvovirus parvovirus by serial at low temperature.Natl.Inat，Anim.Health，1982，(22)，1-7)，Akhiro(Akhiro，et.al，Establishment of the attenuated strain of porcine parvovirus for the live vaccine and its biological-immunological characteristics)培育出了猪细小病毒弱毒活疫苗。

发明内容

本发明的目的是采用免疫原性良好的猪细小病毒(YBF01株)毒株接种于ST细胞(原始ST细胞购自中国兽医药品监察所，基础细胞库和生产用细胞库由本发明人鉴定、建立、保管和供应。该细胞无致瘤性或无致癌性，无细胞毒性，无细菌、霉菌、支原体、外源病毒污染。从现有代次(56代)可连续使用50代。)培养，收获培养物，经甲醛溶液灭活，加入矿物油佐剂混合乳化制成。用于预防由猪细小病毒引起的猪细小病毒病。

一、生产用毒株

1.毒种的来源

制造用猪细小病毒YBF01株，由本发明人2000年在山东省某猪场患病猪流产物分离的一株自然弱毒株(PPV-01株病毒)，用蚀斑克隆技术对该病毒分离株进行克隆，筛选到一株高增殖力毒株，命名为猪细小病毒(Porcine Parvovirus)YBF01株(简称PPV-YBF01株)该病毒毒株已于2011年5月5日送北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.4809。在对该毒株的理化特性及生物学特性进行系列研究、鉴定的基础上，制备了猪细小病毒灭活疫苗。

2.YBF01株病毒毒株的特点

(1)致细胞病变作用 将YBF01株病毒含量不低于10^6.0TCID₅₀/0.1ml的种毒按1％的量接种于长势良好的ST细胞，置37℃培养72～96h，出现细胞圆缩、脱落，继而出现空洞、拉网等特异性病变。

(2)病毒含量将YBF01株毒种用细胞维持液(2％新生牛血清的MEM液，购自GIBCO)进行10倍系列稀释，取10^-4、10^-5、10^-6、10^-74个稀释度，分别接种于长势良好的ST细胞(96孔细胞板)，每个稀释度接种4孔，每孔0.1ml。同时设病毒阳性对照孔和细胞阴性对照孔，37℃培养和观察7日，出现CPE者判为感染，计算TCID₅₀。每0.1ml病毒含量不低于10^6.0TCID₅₀。

(3)红细胞凝集价种毒液对0.5％豚鼠红细胞血凝效价应不低于1∶256。

(4)毒力取怀孕30～50日猪细小病毒抗体阴性(HI抗体效价不高于1∶8)健康初产母猪4头，分别滴鼻和注射YBF01株种毒液各2.0ml，连续观察母猪至分娩，无流产、早产、死胎、木乃伊胎、弱仔等繁殖障碍出现。该毒株毒力较弱，对妊娠母猪安全。

(5)免疫原性