[发明专利]奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌-大肠埃希氏菌二联多价疫苗及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物疫苗及其制备领域，特别是涉及一种奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌-大肠埃希氏菌二联多价疫苗及其制备方法。

背景技术

奶牛乳房炎是影响牛奶产量和质量的最重要传染病。根据国内外研究，奶牛乳房炎的主要病原分传染性病原和环境病原两类。传染性病原主要包括金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和停乳链球菌；环境病原主要有大肠埃希氏菌、乳房链球菌和其它肠杆菌科的细菌。国外研究表明，在奶牛乳房炎病例中金黄色葡萄球菌分离率为15—50%，但在泌乳期由该菌引起的乳房炎治愈率仅为25%，因而该类病原感染所致的乳房炎危害最大；虽然在奶牛乳房炎病例中链球菌的分离率达50%，而由该菌引起的乳房炎治愈率达70—90%。在发达国家，由于先进的饲养管理技术、严格消毒和优越卫生条件，上述疾病比例明显下降，由大肠埃希氏菌引起的乳房炎在一些地区占居优势。我国以及我区(新疆地区)的初步调查表明，金黄色葡萄球菌和大肠杆菌也是当前我区奶牛乳房炎主要的病原。

对于奶牛乳房炎的防治，国外主要采用早期诊断、圈舍环境和乳房消毒、免疫预防以及抗生素预防和治疗。但是，近年来随着消费者安全意识的增强以及国际贸易中食品药物残留监测水平的提高，各国已禁止使用抗生素进行奶牛乳房炎预防，此外，由于长期使用抗生素导致细菌抗药性增强，使奶牛乳房炎的治疗成本急剧增加、治疗效果不明显，并且，由于耐药菌的出现和扩散，也威胁到人类自身的安全与健康。因而研制开发预防奶牛乳房炎疫苗，通过免疫预防进行防制已成为该病防治研究的重点。

目前，国外在乳房炎疫苗的研究和开发中已得到一些成功：美国Nabi生物医药公司（Nabi Biopharmaceutical）的StaphVAX葡萄球菌荚膜多价苗、泛普公司（U.S.PanProbe. Ltd）研制开发的奶牛乳房炎多联疫苗和美国加州大学研制的针对大肠杆菌性乳房炎的高利多疫苗（Golicure—J5）。此外，澳大利亚、以色列、德国、阿根廷、加拿大等国也针对本国奶牛乳房炎中特异的病原，研制开发出了相应的疫苗并进入田间试验。以上国家所研制开发的奶牛乳房炎疫苗技术路线和方法主要有以下几种：（1）针对单一病原的单价或多价疫苗：①金黄色葡萄球菌乳房炎疫苗：澳大利亚CSIRO的Watson从本国奶牛乳房炎病例分离出的金黄色葡萄球菌中筛选出了一株具有较好抗原代表性的菌株，并筛选出了拟体内营养的培养基，使该菌具有重要免疫原性和致病意义的多糖外荚膜和毒素得到充分的表达。他分别提取该菌多糖外荚膜和毒素将其加入灭活全细胞中，选用了合适的佐剂取得了较好的免疫效果（1993）。美国USDA免疫与疫病控制实验室O’Brien等人分别用本国分离出的金黄色葡萄球菌主要血清型P8、P5、P336型制备了金黄色葡萄球菌多聚糖，并将其连接到rEPA上，再与多聚微球结合制备疫苗。用该疫苗免疫牛产生了高效价LgG2抗体和有效抗金黄色葡萄球菌感染免疫（2000）。以色列农业和农村发展部Kimiron兽医研究所的G.Leitner等人从本国患病牛中分出了三株不同生物学特性和毒力的金黄色葡萄球菌，将其分别培养后经一定处理，按比例与佐剂结合制备金黄色葡萄球菌多价疫苗，用该疫苗免疫保护率达70%（2003）；②大肠杆菌乳房炎疫苗：美国加州大学的Hagan等人从奶牛乳房炎患牛中分离出了一株具有不完全O多糖的大肠杆菌变异株，用该菌株裸露的核心抗原制备疫苗在临床应用中可保护多种血清型大肠杆菌的感染（1992）；（2）针对多病原的多联疫苗,由于奶牛乳房炎病原种类多样，研制和开发多联疫苗具有很大的应用潜力,目前国外多联疫苗的研制正在进行之中。但迄今为止，还未见正式的产品研制成功和临床应用的报告。（3）表面多糖血清型是金黄色葡萄球菌的一个重要特征。研究证实，相同多糖血清型菌株之间可以产生交叉免疫保护。金黄色葡萄球菌有11种血清型，奶牛乳房炎中分离的金黄色葡萄球菌的优势血清型为荚膜多糖5型（CP5）、荚膜多糖8型（CP8）和外膜多糖336型（336PS型）。不同国家和地区主要流行血清型并不相同。Poutrel（1988年）对法国分离的212株牛源性金黄色葡萄球菌分型证实，70%为CP5和CP8；美国对其44%的奶牛场分离的金黄色葡萄球菌分型发现，CP5占51%，CP8和未能分型的分别占18%和31%；但这两个国家的研究均未进行336PS的分型。韩国Hong-Ryul Han 等2000年对本国107株奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌进行血清型分型发现，336型占46.7%，CP5和CP8均为12.1%，CP5/336为17.8%，CP5/336为6.5%，未分型的为4.7%。据此，O’Brien等人从美国分离的金黄色葡萄球菌中分别提取CP5、CP8、336PS，将其与绿脓假单胞菌无毒重组外毒素A(rEPA)偶联，再与多聚微球结合制成金黄色葡萄球菌亚单位疫苗免疫奶牛，证实其可有效抵抗抗金黄色葡萄球菌感染。