[发明专利]一种低产氨基甲酸乙酯葡萄酒酵母的筛选及应用

权利要求书

1.一种低产氨基甲酸乙酯的葡萄酒酵母FI5-1-5菌株，其保藏号为CGMCCN04727 。

2.权利要求1所述菌株的筛选方法，该方法包括以葡萄酒酵母为出发菌株，经紫外线—吖啶橙诱变，筛选获得刀豆氨酸抗性FI5-1-5菌株；其过程如下：

（1）以活性干酵母F-15和从葡萄园分离出葡萄酒酵母G-1, 并在混合培养基上长出单菌F-15-A1；

（2）筛选获得刀豆氨酸抗性菌株F-15-A1经活化培养，其条件为取新鲜培养的斜面菌苔一环，加入盛有10mL，5%葡萄糖溶液的三角瓶中，在38~40℃水浴中活化20~30min，直至有大量气泡产生；

（3）将上述培养活化后的菌株，接种至含有刀豆氨酸、精氨酸、鸟氨酸的混合氨基酸初筛培养基中进行培养；

（4）挑取可在混合氨基酸初筛培养基上生长的菌落，分别移接至精氨酸、鸟氨酸复筛培养基中培养；

（5）选择在精氨酸复筛培养基中不能生长，而在鸟氨酸复筛培养基中可以生长的菌种为所需的刀豆氨酸抗性菌株B1，编号为FI5-1-5菌株 (CGMCCN₀4727)；

(6)将分离出来的刀豆氨酸抗性菌株B1，接种YEPD液体培养基活化24h后，吸取0.1mL菌液涂布在混合培养基培养3d，在混合培养基上可以长出菌落的菌株进行保存。

3.权利要求2所述的筛选方法，其中所述经紫外线—吖啶橙诱变的方法是：取生长良好的F-15-A1种子液,在紫外照射90s，然后把600μL经过紫外诱变的菌悬液接入到含有5mL诱变培养基的试管中30℃避光水浴振荡培养12h；其中诱变培养基中含有1mg/mL吖啶橙，剂量分别为80μL，100μL，150μL，200μL，250μL。

4.权利要求2所述的筛选方法，其中步骤(3)中所述的初筛培养基指的是琼脂培养基和刀豆氨酸培养基：其中琼脂培养基为：2%琼脂，2%葡萄糖，50mL纯水在115℃灭菌15min,50℃水浴保温；刀豆氨酸培养基为：1.7g/L YDB，1mg刀豆氨酸，10.0mM鸟氨酸，10mM精氨酸，纯水50MmL，过滤灭菌于50℃水浴保温；将这两种培养基混合，迅速到平板即制得初筛培养基。

5.权利要求2所述的筛选方法，其中步骤(4)中所指的精氨酸、鸟氨酸复筛培养基成分为：(1) 精氨酸培养基：1.7g/L YDB，10mM精氨酸，20g/L葡萄糖，20g/L琼脂；(2)鸟氨酸培养基：1.7g/L YDB，10mM鸟氨酸，20g/L葡萄糖，20g/L琼脂。

6.权利要求2-5任一项所述的筛选方法，其中还包括：验证精氨酸酶活低的葡萄酒酵母，该验证步骤和方法为：将活性干酵母F-15和F-15-A1和B1分别接种到YEPD中，30℃过夜培养，发酵液5000r/min离心5min收集菌体，用无菌水洗3次，转接到精氨酸酶诱导培养基上30℃培养5h，测定活性干酵母F-15、F-15-A1和B1的精氨酸酶的活性，每个菌株作三个重复，1个精氨酸酶的活力单位定义为在pH9.5及37℃下，在0.1M精氨酸溶液中，每min产生1nmol鸟氨酸所用酶的量。

7.权利要求2-5任一项所述的筛选方法，其中还包括：验证氨基甲酸乙酯低的葡萄酒酵母，该验证步骤和方法为：

模拟葡萄汁发酵的验证步骤和方法：

①模拟葡萄汁培养配制：储液A：在375 mL蒸馏水中加入葡萄糖100g，果糖100g，定容至500mL；储液B：在250mL蒸馏水中加入L-酒石酸6g，L-苹果酸3g，柠檬酸0.5 g；储液C：在250mL蒸馏水中加入无硫酸氨的氮基础培养基1.7g，肌醇6 mg，氯化钙0.2g，磷酸铵1g，L-精氨酸0.8g，L-脯氨酸1g，DL-色氨酸0.1g；将储液A、B、C混合后用氢氧化钾调节pH至3.25，过滤除菌；

   ②模拟葡萄汁发酵：将编号为FI5-1-5菌株(CGMCCN04727)斜面保存的菌苔转接到装有50mL模拟葡萄汁培养基的三角瓶中，在30℃，150r/min条件下过夜培养；然后再将50mL过夜培养物转接到500mL模拟葡萄汁培养基中，在26℃下静置厌氧发酵5～7天，发酵结束后取样测定氨基甲酸乙酯含量。

8.权利要求2-4所述的筛选方法，其中被筛选的葡萄酒酵母F-15-A1、G-1为未经基因修饰的酵母；筛选出的编号为FI5-1-5菌株是经过基因修饰的。