[发明专利]一种纯化培养甘薯腐烂茎线虫的方法

说明书

技术领域

本发明属于植物病原线虫生物学领域，涉及腐烂茎线虫种群高质量纯化培养的方法。

技术背景

甘薯腐烂茎线虫病是我国农业上的重要病害，在国内主要分布于河南、河北、山东、山西、安徽、江苏等省区。其病原物甘薯腐烂茎线虫（Ditylenchus Destructor）最早在马铃薯上发现，导致马铃薯腐烂（Thorne G，1945年提出）。甘薯茎线虫病是我国甘薯产区的重要病害之一，其病原腐烂茎线虫是我国重要的检疫性对象。近年来由于甘薯生产上引种不当，造成甘薯茎线虫病的大面积蔓延 。 危害越来越严重，已经危及了甘薯的生产。该病害是由线虫危害引起的，病原经南京农业大学丁再福，林茂松等鉴定是马铃薯腐烂茎线虫(Ditylenchus destructor) ，这是植物寄生线虫中惟一引起植物干腐症状的病原物，甘薯受到马铃薯腐烂茎线虫的侵染，轻者减产10％-30％，重者达50％-80％，甚至绝收。该线虫除了危害马铃薯、甘薯，还危害胡萝卜、花生、薄荷等。  

获得群体纯度高、生命力良好的线虫是系统研究该线虫生物学特性、致病机理、种群群体及个体遗传变异等工作的基础和前提。

目前系统进行纯化培养该线虫的方法，一般通过下述几种渠道获得，如在P D A平板中接入茄腐镰刀菌( Fusariumsolani )、灰葡萄孢( Botrytis cinereaPers) 和毛壳菌 ( Chaetomiumsp)，25℃温箱中暗培养腐烂茎线虫，另外刘斌等人报道采用玉米培养基培养的灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)对腐烂茎线虫进行的单异活体培养，在室内可以快速和大量繁殖腐烂茎线虫（刘   斌，郑经武，2006,浙江农业学报）；阮龙等人报道采用甘薯发根单寄主培养体系繁殖马铃薯腐烂茎线虫的方法（阮　龙，吴　飞，姜　疆等，生物技术通报，2006第六期），上述纯化培养方法都是通过接种大量线虫获得成功，且纯化成功的基础是在大量线虫接种前进行腐生线虫等其他虫体的去除，如漆永红等人报道在接种线虫前先吸出400至 500条腐烂茎线虫， 然后在显微镜下去除腐生线虫(漆永红，李秀花，马娟. 华北农学报. 2008)。上述方法在实际应用中如果线虫群体纯度不高，且携带其他土壤线虫的话，去除这些杂虫所需工作量必然加大，难免携带杂虫， 降低了培养的纯度，这对于快速接种、高质量纯化线虫带来不便，同时上述纯化培养繁殖方法虽然给快速大量繁殖线虫带来了便利，但若腐烂茎线虫在真菌上长时期繁殖培养（寄主发生改变的情况下），可能在致病力等生物学特性方面发生转变。阮龙等人报道采用甘薯发根单寄主培养体系繁殖马铃薯腐烂茎线虫的方法不仅存在着上述缺陷，而且方法非常繁杂。因此，高质量纯化培养线虫显得非常重要。  

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种纯化培养甘薯腐烂茎线虫的方法，该方法不仅简单、容易操作，而且获得的线虫群体纯度高、生命力好。

本发明通过以下技术方案实现：

一种纯化培养甘薯腐烂茎线虫的方法，包括下列步骤：

（1）线虫的准备

在40×体式显微镜下用针挑取腐烂茎线虫的大龄幼虫、雄虫放到器皿中备用； 

（2）纯化培养

将整薯横向或纵向切开，在其中的一个断面上打孔，在每个孔里注入少许无菌水，以不溢出孔为准，之后将步骤（1）得到的腐烂茎线虫，一条大龄幼虫和两条雄虫接入一个小孔内，再将切下的薯块做为天然保湿盖盖在接入腐烂茎线虫后的薯块上，用石蜡将边缘缝隙密封好，并用弹性材料捆绑后平放在培养箱里，于25℃培养30天，用直径为13毫米打孔器将接种过线虫的小孔取下分别进行线虫分离。

本发明进一步改进方案是，一种纯化培养甘薯腐烂茎线虫的方法，包括下列步骤：

（1）线虫的准备

在40×体式显微镜下用针挑取腐烂茎线虫种群雌虫放在玻片上，在 100×显微镜下进一步确认为受孕雌虫，然后放到器皿中备用； 

（2）纯化培养

将整薯横向或纵向切开，在其中的一个断面上打孔，在每个孔里注入少许无菌水，以不溢出孔为准，之后将步骤（1）得到的腐烂茎线虫，一条接入一个小孔内，再将切下的薯块做为天然保湿盖盖在接入腐烂茎线虫后的薯块上，用石蜡将边缘缝隙密封好，并用弹性材料捆绑后放置在培养箱里，于25℃培养30天，用直径为13毫米打孔器将接种过线虫的小孔取下分别进行线虫分离。