[发明专利]一种产丙酮酸的酿酒酵母基因工程菌及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种产丙酮酸的酿酒酵母基因工程菌，其特征在于该基因工程菌可以积累丙酮酸。

2.权利1所述的基因工程菌，其特征在于硫胺素合成途径的调控基因被敲除，导致通往乙醇的代谢通量大大减少。

3.权利要求1所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

第一步：敲除盒的构建

以质粒pUG27为模板，以带有与待敲除基因上下游同源序列的引物，扩增出带有HIS标记的LoxP-KanMX-LoxP基因敲除盒；

第二步：敲除盒的转化及转化子的验证

将构建好的敲除盒，用LiAc的转化方法转化到酿酒酵母菌株(Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1C)，PCR验证阳性菌落；

第三步：HIS标记的删除

利用pSH47质粒上Cre/Loxp重组酶系统删除HIS标记，最后通过PCR验证，确认标记删除。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于发酵生产的工艺为：将30℃、200rpm下培养12h的基因工程菌种子以5％的接种量转入发酵培养基于30℃、200rpm条件下培养96h，因S.cerevisiae CEN.PK2-1C(ΔTHI2)为缺陷型菌株，培养基需添加不同浓度的Leu、Trp、Ura、His，并且硫胺素的添加量为0.04μM。