[发明专利]一种HIV重组亚型DNA疫苗的制备方法

权利要求书

1.一种HIV重组亚型DNA疫苗的制备方法，其特征在于，通过以下步骤实现：

(1) 设计与合成密码子优化后的融合基因序列，

(2) DNA疫苗的构建和体外表达能力测定，

A：重组质粒的酶切鉴定与测序：将构建的重组质粒AE-Gp145TRN用BamHI和XbaI进行双酶切，酶切产物进行l%琼脂糖凝胶电泳，其中，Gp145TRN融合基因的片段长度为3423bp，载体片段长度为5071 bp，电泳结果显示：酶切结果与预期结果完全一致，DNA双向序列测定结果显示：插入序列与设计的序列完全一致；

B：TRIVN融合蛋白真核表达：用LipofectamineTM 2000将空载体质粒与重组质粒AE-Gp145TRN分别转染293T细胞，培养48 h后收集细胞，并制备蛋白样品进行Western-Blot验证，在各泳道上样量基本相当的情况下，Western-Blot结果显示，重组质粒转染产物中出现约190KDa的特异性条带，与预期大小一致。

2.根据权利要求1所述的一种HIV重组亚型DNA疫苗的制备方法，其特征在于，Gp145-Tat-Rev-Nef编码基因的密码子优化和基因合成是通过Los Alamos HIV Database调取HIV-1AE2f株的全基因信息，使用J Cat在线软件，按照哺乳动物的密码子偏好进行密码子优化，在抗原基因密码子优化合成过程中，按照文献报道对2个基因分别进行了定点突变：Tat：C27S/K51T/R55L/G79A，Nef：K144R/D174K，合成基因简称为AE-Gp145TRN。

3.根据权利要求1所述的一种HIV重组亚型DNA疫苗的制备方法，其特征在于，按常规分子克隆方法将Sal I和EcoR V双酶切的tat-rev-integrase(c-half)-vif-nef基因连接入表达载体，通过限制性酶切和DNA测序的方法对所构建的质粒进行鉴定后，采用德国QIAGEN公司EndoFree Plasmid Giga Kit试剂盒进行大量制备，制备好的无内毒素的质粒溶于无菌的PBS溶液中，pH7.2，调整浓度为lmg/ml。

4.根据权利要求1所述的一种HIV重组亚型DNA疫苗的制备方法，其特征在于，采用覆盖HIV-1AE2f 亚型Env，Tat，Rev，Integrase，Vif和Nef全长蛋白的肽库来进行特异性T细胞反应检测。