[发明专利]一种玉米中活性次生代谢物-丁布的提取方法

说明书

技术领域

本发明属于植物次生代谢物提取制备技术领域，具体涉及一种玉米中活性次生代谢物-丁布的提取方法。

背景技术

植物在生态系统中占有重要的地位，同时也是次生代谢产物的天然宝库。植物与植物、植物与微生物、植物与动物之间普遍存在着通过次生代谢物为媒介的化学关系^[1]。大量研究表明，植物产生的次生代谢物质具有化学防御功能^[2]，因此寻找植物源抗菌或杀虫化合物一直是国际植物保护、新农药研发中关注的热点。

异羟肟酸(2，4-二羟基-2H-1，4-苯并噁嗪-3(4H)-酮)及其衍生物是广泛存在于玉米(Zea mays L.)等禾本科作物中的一类重要的次生代谢物^[3，4]。丁布(DIMBOA，2，4-二羟基-7-甲氧基-1，4-苯并口噁嗪-3-酮)是玉米中含量最丰富的一类异羟肟酸^[5-8]。丁布在正常植物体内以β-D-葡萄糖苷无毒形式存在，由于机械损伤或害虫、病菌侵入造成细胞膜系统的破坏和内含物混合，在分布于细胞壁上的葡糖苷酶的作用下，丁布糖苷水解，释放出有活性的丁布。自1959年Wahlroos等指出在玉米抗性中起主要作用的是2，4-二羟基-7-甲氧基-1，4-苯并恶嗪-3-酮以来，人们对其研究日渐深入，目前研究已经证实丁布具有抗病，抗虫及化感作用，在玉米、小麦等禾本科作物中广泛存在，引起了昆虫学家、化学家、病理学家和育种学家的广泛关注。因此，建立一个高效、简便、安全经济的丁布提取方法，是全面彻底研究丁布在作物化学防御中所起作用的重要前提。

丁布的提取方法最早是由Wahlroos等于1959年提出的^[5]。其具体提取步骤为：称取在温室自然光照条件下培养10天的玉米绿色幼苗地上部分400g，榨汁处理，室温静置30分钟。随后离心40min(离心力为10000g)。转移上清液，用乙醚萃取2次。收集合并乙醚相，无水硫酸钠脱水后，减压浓缩后。剩余固体利用甲醇-乙醚溶解，加入过量乙醚重结晶；随后再将晶体溶于环己烷，加入过量乙醚重结晶。1962年，Hamilton等从玉米中提取丁布方法如下^[6]：取3.6kg黑暗条件下培养5d的玉米黄花苗，加入足量乙醇后匀浆。过滤，滤液在37℃下减压浓缩。再将浓缩液pH调至4，用等体积乙醚萃取3次。合并乙醚相，减压浓缩至500ml。再用100ml 8％碳酸氢钠溶液萃取2次，合并碳酸氢钠溶液，将pH调至4，再用等体积乙醚萃取3次，合并乙醚相，在1℃下过无水硫酸钠，减压浓缩至干。所得物质用5ml乙醚洗涤2次，溶解于少量热丙酮中，加入过量石油醚多次重结晶。1967年，Klun在Wahlroos和Hamilton建立方法基础之上做了改进，具体步骤如下^[7]：黑暗条件下培养的玉米黄花苗，加入2倍体积的蒸馏水匀浆。纱布过滤，室温静置1h，快速升温至65℃，在迅速用冰水浴降温。滤纸过滤，滤液用过量乙醚萃取多次，收集合并乙醚相，无水硫酸镁脱水处理后，浓缩至干。所得残留物质用少量三氯甲烷/乙醇(95∶5，V∶V)冲洗2次，剩余固体用丙酮丙酮溶解，加入正己烷多次重结晶。1978年，woodward等在Klun等前人工作基础上，建立了如下提取方法：在28℃恒温、黑暗条件下培养7d的玉米黄化苗(238g)，加入480ml水后匀浆，匀浆物室温条件下静置50min，纱布过滤，快速升温至65℃，再迅速冷却至10～15℃，过滤，滤液用乙醚萃取，于真空条件下干燥，所得物质置于-20℃的冰箱中冷冻固化5d，用0.2ml的三氯甲烷/甲醇(95∶5，V∶V)冲洗2次，剩余固体用1ml丙酮清洗(溶于丙酮中，加入正己烷)，用活性炭脱色，产生白色针状结晶，即为丁布^[8]。上述几种丁布提取方法过程大同小异，均存在提取步骤繁琐，耗费大量较高毒性溶剂等缺点。