[发明专利]一种Her-2/neu重组腺相关病毒载体及其构建方法与应用

权利要求书

1.一种Her-2/neu重组腺相关病毒载体，是将腺相关病毒载体中的腺相关病毒结构基因替换为Her-2/neu抗原基因或其突变型基因得到的重组腺相关病毒载体。

2.根据权利要求1所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于：将所述重组腺相关病毒载体中的p5启动子替换为巨噬细胞病毒启动子、beta肌动蛋白启动子和SV40病毒启动子中的一个或几个启动子。

3.一种构建权利要求1所述重组腺相关病毒载体的方法，是先将腺相关病毒载体中的腺相关病毒结构基因剔除，再用所述肿瘤抗原Her-2/neu基因或其突变型基因取代该剔除基因，得到重组腺相关病毒载体。

4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于：所述方法还包括将所述重组腺相关病毒载体中的p5启动子替换为巨噬细胞病毒启动子、beta肌动蛋白启动子和SV40病毒启动子中的一个或几个启动子的步骤。

5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：

A.pBR-AAV2质粒的改建：先用限制性内切酶Bst98 I和Hpa I将pBR-AAV2质粒中的腺相关病毒AAV基因组的结构基因Rep和Lip/Cap基因完全切除，然后将含有限制性内切酶EcoR I和EcoR V酶切位点的核苷酸序列CGAATTCATGCGATATCGTT插入质粒中，保留两端完整的TR序列或将AAV基因组的两端TR的第75位核苷酸序列处均插入由9个核苷酸组成的片段CTGCGCTGG；

B.采用基因扩增技术扩增CMV启动子和SV40早期启动子；

C.PCR扩增beta肌动蛋白启动子、全长Her-2/neu cDNA和部分Her-2/neucDNA片段；

D.采用DNA连接技术，将上述扩增的CMV启动子、SV40早期启动子、beta肌动蛋白启动子、全长Her-2/neu cDNA或部分Her-2/neu cDNA片段依次插入步骤A经改建的pBR-AAV2载体中，为插入启动子，首先进行酶切反应，然后进行连接反应，得到携带有CMV启动子、SV40早期启动子、beta肌动蛋白启动子和全长Her-2/neu cDNA的Her-2/neu重组腺相关病毒载体(命名为rAAV/Her-2/neu)，或携带有CMV启动子、SV40早期启动子、beta肌动蛋白启动子和Her-2/neu cDNA片段的突变型Her-2/neu重组腺相关病毒载体(命名为rAAV/mHer-2/neu)。

6.与权利要求1或2所述或权利要求3或4或5所述方法制备得到的Her-2/neu重组腺相关病毒载体相关的产品，包括Her-2/neu重组腺相关病毒载体质粒、Her-2/neu重组腺相关病毒或被Her-2/neu重组腺相关病毒载体感染或转染的细胞系。

7.权利要求6所述Her-2/neu重组腺相关病毒载体相关的产品的制备方法，分别为：

Her-2/neu重组腺相关病毒载体质粒的制备：在权利要求5所述方法A-D步骤后增加步骤E：将连接后的DNA-rAAV/Her-2/neu或rAAV/mHer-2/neu分别导入基因工程大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞，用含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板进行抗性筛选，挑取白色单菌落，提取质粒并纯化，得到rAAV/Her-2/neu质粒和rAAV/mHer-2/neu质粒；

Her-2/neu重组腺相关病毒的制备：以所述Her-2/neu重组腺相关病毒载体质粒和pHelper质粒共转染AAV-HEK293细胞(宿主细胞)得到Her-2/neu重组rAAV病毒或突变型Her-2/neu重组rAAV病毒，分别命名为rAAV/Her-2/neu病毒和rAAV/mHer-2/neu病毒；

Her-2/neu重组腺相关病毒载体感染或转染的细胞系的制备：用所述Her-2/neu重组腺相关病毒分别或依次感染或转染单核细胞、树突状细胞(DC)和T淋巴细胞(CTL)得到，所述细胞系包括单核细胞-树突状细胞系和T淋巴细胞系。

8.权利要求1或2所述的Her-2/neu重组腺相关病毒载体在制备抗乳腺癌、结肠癌、肺腺癌和卵巢癌药物中的应用。