[发明专利]基于基因沉默技术的灰飞虱致死基因片段Alpha1-tubulin及其dsRNA

权利要求书

1.灰飞虱致死基因片段Alpha1-tubulin，其特征在于序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述的灰飞虱致死基因片段Alpha1-tubulin的克隆方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)取灰飞虱，提取总RNA，以提取的灰飞虱总RNA合成cDNA第一条链；

(2)以步骤(1)合成的灰飞虱cDNA第一条链为模板，以序列为SEQ ID NO.2的上游引物P1、序列为SEQ ID NO.3的下游引物P2进行RT-PCR扩增；

(3)PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离，回收目标DNA片段；

(4)将回收的目标DNA片段在T3连接酶作用下插入至pEASY-T3载体中，转化到大肠杆菌T1，涂于含有X-gal、IPTG以及氨苄青霉素的LB培养基，37℃培养，过夜；

(5)通过挑选白色单菌落，筛选阳性重组子；

(6)用含氨苄青霉素的LB培养液将重组子扩增，提取克隆质粒；

(7)全自动序列仪进行测序，得到SEQ ID NO.1所示的Alpha1-tubulin基因片段。

3.根据权利要求2所述的灰飞虱致死基因片段Alpha1-tubulin的克隆方法，其特征在于所述的RT-PCR扩增体系为：反应缓冲液5μL，Mg²⁺4μL，dNTP 4μL，cDNA模板2μL，上游引物1μL，下游引物1μL，R-Tag酶0.5μL，ddH₂O 32.5μL，共50μL；PCR反应程序为：94℃变性2min，94℃30sec，55℃30sec，72℃30sec，35个循环，72℃延伸。

4.权利要求1所述的灰飞虱致死基因片段Alpha1-tubulin的dsRNA，其特征在于序列如SEQ IDNO.4所示。

5.权利要求4所述的灰飞虱致死基因片段Alpha1-tubulin的dsRNA的合成方法，其特征在于：以灰飞虱cDNA第一条链为模板，以序列为SEQ ID NO.5的上游引物P3、序列为SEQ ID NO.6的下游引物P4进行PCR扩增得到灰飞虱致死基因片段Alphal-tubulin的dsRNA。

6.根据权利要求5所述的灰飞虱致死基因片段Alpha1-tubulin的dsRNA的合成方法，其特征在于包含如下步骤：

(1)根据已经验证的Alpha1-tubulin基因片段序列，设计并合成序列为SEQ ID NO.5的P3和序列为SEQ ID NO.6的P4，以灰飞虱cDNA第一条链为模板PCR扩增得到灰飞虱致死基因片段Alpha1-tubulin的dsRNA，PCR体系为：反应缓冲液5μL，Mg²⁺4μL，dNTP 4μL，cDNA模板2μL；上游引物2μL，下游引物2μL，ExTap酶0.25μL，ddH₂O 30.75μL，共50μL；PCR条件为：94℃变性2min，94℃30sec，55-62℃30sec，72℃30sec，38个循环，72℃延伸；

(2)PCR产物经浓度为1％的低熔点琼脂糖凝胶电泳分离；

(3)回收目标DNA产物。

7.一种灰飞虱的dsRNA喂食方法，其特征在于包含如下步骤：

(1)将玻璃管的一端封好，用吸虫器吸取二龄的灰飞虱加入玻璃管内，用纱布将玻璃管另一端封好；

(2)将虫子拍打至玻璃管封口端，将另一端的纱布取下，将已经准备好的封口膜，贴纸的一面朝上，盖到玻璃管管口上，将管竖立放置；

(3)用移液枪吸取含dsRNA的饲料滴在膜的中央，用一个新的封口膜，贴纸的一面朝下，贴在玻璃管管口上，将饲料和dsRNA封在两层封口膜之间；

(4)将加好饲料和dsRNA的玻璃管放回养虫室的养虫架上，房间温度为26℃，利用灰飞虱的趋光习性仅在饲料端给予光照，使其趋食饲料，每24h换一次含dsRNA的饲料。

8.根据权利要求7所述的dsRNA喂食方法，其特征在于所述的dsRNA为权利要求4所述的灰飞虱致死基因片段Alpha1-tubulin的dsRNA。