[发明专利]一种修饰性谷胱甘肽过氧化物酶及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种修饰性谷胱甘肽过氧化物酶及其制备方法。

背景技术

谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,EC1.11.1.9,简称GPx)是生物机体组织中存在的三种重要的抗氧化酶之一,也是一种重要的含硒酶,硒是该酶活性中心的构成成分。它可以消除机体内的过氧化氢及脂质过氧化物,阻断活性氧自由基对机体的进一步损伤,是生物体内重要的活性氧自由基清除剂,它以硒代半胱氨酸(Sec) 的形式发挥作用,以谷胱甘肽(GSH)为还原剂分解体内的脂质过氧化物,因而可防止细胞膜和其它生物组织免受过氧化作用的损伤；它与体内的超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)一起构成了机体的抗氧化防御体系。医学研究表明它与人类许多疾病有关，对肿瘤、心血管疾病、老年性疾病、不孕症等多种疾病有着良好的预防和治疗作用，是一种有广泛应用和市场前景的医药用酶。但该酶在常温条件下其巯基易氧化而使酶失活、半衰期非常短、稳定性差等特性限制了该酶的以常态形式使用的实用性。对该类酶进行化学修饰以提高其物理、化学和生物学稳定性是成功开发并推出市场的关键性技术。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种酶活性高、稳定性强的修饰性谷胱甘肽过氧化物酶。

本发明的另一个目的在于提供制备该修饰性猪谷胱甘肽过氧化物酶的方法。

本发明公开了一种修饰性谷胱甘肽过氧化物酶，由谷胱甘肽过氧化物酶的氨基与活化的单甲氧基聚乙二醇连接，其结构式为：

其中GP_x表示谷胱甘肽过氧化酶。该谷胱甘肽过氧化物酶来源于猪体内。

本发明同时公开了该修饰性谷胱甘肽过氧化物酶的制备方法，采用活化的单链单甲氧基聚乙二醇作为修饰剂，与谷胱甘肽过氧化物酶反应，将单链单甲氧基聚乙二醇(mPEG₁)通过游离氯原子与谷胱甘肽过氧化物酶的氨基发生反应，使mPEG₁与谷胱甘肽过氧化物酶连接。反应式如下。

本发明同时也公开了该修饰性谷胱甘肽过氧化物酶的制备方法，包括以下步骤：采用活化的单链单甲氧基聚二醇作为修饰剂，与谷胱甘肽过氧化物酶在4-37℃、pH 7.0-10.0下反应，其中单链单甲氧基聚二醇与谷胱甘肽过氧化物酶的质量比为20-100 : 1。反应15-60min后，加入终止剂GSH结束反应，超滤去除终止剂，获得所述的修饰性谷胱甘肽过氧化物酶。

其中，优选的方案为：单链单甲氧基聚二醇与谷胱甘肽过氧化物酶的质量比为80 : 1；反应条件为温度15℃、pH 9.0、时间45min。

其中的活化的单链单甲氧基聚二醇，可以通过以下方法获得：取5.5g二次重结晶的三聚氰氯（先用无水苯重结晶两次）溶解于400mL含10g无水碳酸钠的无水苯中，加入50g mPEG-5000，室温下搅拌过夜，过滤，取滤液约400mL搅拌下缓慢加入600mL乙醚，沉淀出白色产物后继续搅拌20min，抽滤，沉淀再用400mL无水苯溶解，如此沉淀、溶解重复多次，直到紫外检测无三聚氰氯的吸收峰为止。将活化的mPEG₁置于真空干燥器中抽干，得到白色粉末，即获得活化mPEG₁。

本发明采用来源于猪体内的谷胱甘肽过氧化物酶为实验对象，与现有技术相比，本发明具有以下有益效果。

（1）本发明首次采用单链单甲氧基聚乙二醇(mPEG₁)修饰谷胱甘肽过氧化物酶，经过测定残余氨基修饰率（DTNB法）鉴定，其氨基修饰率为44.55%；由于氨基修饰率达40%以上时进入体内就可完全消除异体蛋白的抗原抗体反应，因此本发明的修饰性谷胱甘肽过氧化物酶具有消除酶蛋白抗原抗体反应的优点。

（2）本发明所获得的修饰性谷胱甘肽过氧化物酶，酶活力保持率高达104.66%，即修饰酶活力比天然酶的活力更高。

（3）酶的pH稳定性与热稳定性提高。与天然酶相比，修饰酶的pH稳定性要宽一些，在pH4.0和pH10.0的条件下放置1.5h，天然酶的相对活力分别为0%和38.83%，而修饰酶的相对活力分别为21.08%和68.79%；热稳定性也比天然酶高一些，在50℃时未修饰GPx的相对活力为0%，而修饰GPx保持了37%的活力。

（4）修饰酶的半衰期比天然酶延长了。修饰酶的半衰期为180.77h，天然酶的半衰期为76.28h，修饰酶的半衰期是原酶的2.37倍