[发明专利]甘蔗花叶病毒中国保定分离物及其基因组全序列

说明书

技术领域

本发明涉及微生物基因组学和植物保护领域，特别是涉及一种甘蔗花叶病毒的基因组全序列及其应用。 

背景技术

玉米矮花叶病是一种重要的世界性病害。该病于1963年首先在美国俄亥俄州发现¹⁰，至今已先后在世界20多个国家的玉米主产区发现。我国玉米矮花叶病最早于1968年在河南新乡和安阳发现，目前已遍布全国各玉米种植区，给当地的玉米生产造成了不同程度的损失，其中以华北和西北损失最重。 

导致玉米矮花叶病的病毒目前已鉴定的有：玉米矮花叶病毒(Maize dwarf mosaic virus，MDMV)，甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus，SCMV)，约翰逊草花叶病毒(Johnsongrass mosaic virus，JGMV)，玉米属花叶病毒(Zea mosaic virus，ZeMV)，白草花叶病毒(Pennisetum mosaic virus，PenMV)和高粱花叶病毒(Sorghum mosaic virus，SrMV)，上述6种病毒共同组成了马铃薯Y病毒属中侵染禾本科植物的甘蔗花叶病毒(SCMV)亚组。而目前引起我国玉米矮花叶病的病毒主要为甘蔗花叶病毒和白草花叶病毒。 

病毒的分类主要基于血清学，生物学和分子生物学方法，其中通过分子水平对病毒进行分类变得越来越重要，随着测序技术的不断改善，成本的降低，通过测得病毒的序列来对病毒进行分类已经是当今最重要的方法之一。目前对于马铃薯Y病毒属病毒的分类大多是基于对某个基因的核苷酸或氨基酸序列进行分析研究，但由于这些基因只能代表病毒全基因组的一部分，因此基于病毒基因组全序列对病毒进行分类研究将会更可靠也更有意义。在最新的国际病毒分类学委员会(ICTV)第八次病毒分类报告中对马铃薯Y病毒属内病毒种类的划分标准做了规定：CP氨基酸序列一致率＜80％，全基因组核苷酸序列一致率＜85％，而在另外一项研究中显示对于马铃薯Y病毒属病毒种类最优划分标准应为ORF和CP的核苷酸序列一致率均＜76％。正是基于分子生物学证据才明确，导致我国玉米矮花叶病的病毒均属于甘蔗花叶病毒，且是不同于SCMV-MDB的另一个株系。 

SCMV属于马铃薯Y病毒属，它可通过蚜虫以非持久方式传播，也可通过种子带毒进行远距离传播，因此需要通过对导致玉米矮花叶病的SCMV全序列的测定分析，来掌握其株系变异情况，构建快速检测体系，培育抗病新品种，制定积极防控措施，从而保证玉米生产的安全。 

因此如何获知这一主要致病病毒的全序列，并应用该全序列进行疾病的防控，就成为了现在亟待解决的问题之一。 

发明内容

基于上述的原因，发明人利用国内现有的病毒资源，从患病植株中获得了一种病毒分离物的基因组全序列，发明人将其命名为甘蔗花叶病毒(SCMV)保定分离物(BD8)(简称 SCMV-BD8)，通过将该序列与已有的SCMV基因组全序列进行对比分析可用于明确我国SCMV株系的存在和分布情况，为设计RT-PCR快速检测引物和构建RNA沉默载体培育转基因抗病玉米新品种提供依据，也可为制定相应的玉米生产防控措施提供理论依据。 

本发明所提供的甘蔗花叶病毒中国保定分离物基因组全序列，其基因组全序列如SEQ IDNO.1所示，其蛋白序列也就是开放阅读框架编码的氨基酸的序列如SEQ ID NO.2所示； 

该病毒基因全序列的测定方法如下：从一株表现明显花叶症状的玉米叶片总RNA进行提取，根据GenBank已登录的SCMV全序列保守区域设计引物(见表1)，运用RT-PCR方法进行扩增，得到的基因片段经纯化回收以后连接到pMD18/19-T载体中形成重组质粒，再通过热激转化的方法将其转化到感受态大肠杆菌DH5α中，经氨苄青霉素的筛选，挑取单斑扩大培养后利用碱法小量提取质粒，经质粒PCR确定为阳性菌株后将其送至测序公司对目的基因片段进行测序。5′末端非翻译区(5′UTR)利用cDNA 5′末端快速扩增法(5′RACE)获得。得到的各片段序列用DNAMAN软件包(Lynnon BioSoft，ver.5.2.2)和DNASTAR 5.00软件包(DNASTAR Inc.，USA)中的SeqMan进行序列拼接，最终得到完整的SCMV-BD8核苷酸全序列。 

表1BD8基因片段扩增所用引物