[发明专利]王不留行抗新生血管有效部位的纯化与应用

说明书

技术领域

本发明涉及从王不留行种子里提取到粗皂苷，以细胞活性评价为指标，以薄层-分光光度法测定皂苷含量，采用大孔吸附树脂法和硅胶柱层析法纯化精制粗皂苷，得到有较高活性和较纯的抗新生血管有效部位皂苷组分。

背景技术

大孔树脂(macroporous resin)又称全多孔树脂聚合物吸附剂，是一种不溶于酸、碱及各种有机溶剂的高分子聚合物。以吸附为特点，对有机物具有浓缩、分离作用。大孔树脂的孔径与比表面积都比较大，在树脂内部具有三维空间立体孔结构，具有物理化学稳定性高、比表面积大、吸附容量大、选择性好、吸附速度快、解吸条件温和、再生处理方便、使用周期长、宜于构成闭路循环、节省费用等诸多优点。本研究使用的D101大孔吸附树脂具有良好的网状结构和很高的比表面积，可以通过物理吸附从水溶液中有选择地吸附有机物质，从而达到分离提纯的目的，且具有快速、高效、方便、灵敏、选择性好等优点。目前，D101大孔吸附树脂在中药的分离纯化中应用广泛。

硅胶柱层析法(Silica gel column chromatography)是根据物质在硅胶上的吸附力不同而得到分离，一般情况下极性较大的物质易被硅胶吸附，极性较弱的物质不易被硅胶吸附，整个层析过程即是吸附、解吸、再吸附、再解吸过程。目前，硅胶柱层析法已应用于很多中药的单体分离。

王不留行[Vaccaria segetalis(neck.)Garcke]为双子叶植物石竹科麦蓝菜的干燥成熟种子。对行血通经，催生下乳，消肿敛疮；妇女闭经，乳汁不通，难产，血淋，痈肿，金疮出血等有很大效用。主要含有三萜皂苷，黄酮苷，环肽，类脂和脂肪酸，单糖等。研究表明：王不留行水提取具有较强抑制血管生成的作用[1、花慧，冯磊，张小平，张连芬，金坚.王不留行抑制血管生成的活性物质研究.时珍国医国药.2009，20(3)：698-700.]，在此研究基础上，夏明星等人把王不留行水煎剂用大孔吸附树脂法乙醇洗脱等纯化方法得到了抑制人微血管内皮细胞增殖的单一组分群[2、夏明星，冯磊，张莲芬，李英，储敏，金坚.王不留行中抗人微血管内皮细胞增殖的有效组分的分离和纯化.生物技术通报.2009，2：93-97.]，并且高越颖通过不同路线提取的皂苷经毒理学和药效学研究表明王不留行经乙醇提取正丁醇萃取得到的皂苷是抑制内皮细胞增殖的有效部位[3、高越颖，蒋秋龙，冯磊，邱丽颖，金坚.王不留行不同提取部位抑制新生血管作用的研究.海峡药学.2010，22(12)：34-37.]，因此本研究以细胞活性评价为指标，薄层-分光光度法测定皂苷含量，采用大孔吸附树脂法和硅胶柱层析对王不留行粗皂苷进行纯化精制。

发明内容

本发明的目的是以细胞活性评价为指标，以薄层-分光光度法测定皂苷含量，将王不留行抗新生血管有效部位皂苷进行纯化。

本发明的技术方案：

所述王不留行皂苷的制备方法，取王不留行种子，粉碎，石油醚浸泡脱脂，晾干，加乙醇溶液加热回流，冷却过滤，旋转蒸发至干，去离子水复溶，依次用二氯甲烷、乙酸乙酯、水饱和正丁醇萃取，旋干，加水复溶，真空干燥得粗皂苷。

所述大孔吸附树脂法纯化粗皂苷，装柱，95％乙醇洗至洗脱液溶于水不浑浊，再用去离子水洗至无醇味，粗皂苷溶于水后上样吸附，去离子水洗至无糖，再依次用30％、50％、75％、95％浓度乙醇洗脱，收集各洗脱液，旋干，加水复溶，真空干燥。

所述细胞活性评价各洗脱组分，将-80℃冰箱中的人微血管内皮细胞复苏，正常培养后用2％培养液饥饿，24h后加到96孔板里培养，48h后加药即各洗脱液和粗皂苷，继续培养，加药48h后SRB法染色，用酶标仪在540nm波长下测OD值。

所述硅胶柱层析法纯化大孔树脂洗脱组分，以氯仿-甲醇体系为洗脱剂梯度洗脱，控制一定的流速和每管体积。将各收集管的溶液用TLC法进行鉴别，以正丁醇-乙酸乙酯-水为展开剂，10％硫酸乙醇为显色剂，合并有皂苷物质的组分。

所述细胞活性评价硅胶柱得到的组分，用上述方法将硅胶柱洗脱组分与大孔树脂洗脱组分、粗皂苷进行活性比较。

所述薄层-分光光度法测定皂苷含量，以人参皂苷Re为对照品，作一条标准曲线，在线性范围内测定粗皂苷、大孔树脂洗脱液、硅胶柱层析洗脱液的皂苷含量。

本发明的有益效果：

本发明得到了王不留行粗皂苷的一条纯化工艺路线，在细胞活性评价中也证实了对人微血管内皮细胞有较好的细胞活性，有利于后期的实验研究，从硅胶柱层析中得到的较纯组分进一步分离得到细胞活性有效的单体化合物。

具体实施方式