[发明专利]一种用于病毒噬斑纯化和克隆混合胶溶液配制的新方法

说明书

技术领域

本发明涉及病毒噬斑纯化和克隆混合胶液的配制，采用的新方法与常规方法相比，提高了单位面积的细胞数量和单克隆纯化病毒粒子的数量，降低了实验成本，提高实验功效。

背景技术

常规的病毒噬斑、纯化和（细胞）克隆方法是使用（2～10）×培养基与低熔点胶按相应比例混合后，覆盖于接毒后的单层细胞，但是使用（2～10）×培养基用于病毒噬斑、纯化和（细胞）克隆，需要提前将（2～10）×培养基配制好，低熔点胶提前高压灭菌后备用;此方法程序烦琐，且培养基与胶混合后溶液的pH值、渗透压将会发生改变，影响了细胞的生长状态，进而影响病毒克隆的效果。

文献检索披露的病毒克隆纯化SOP：2%胶的配制;称取2克胶，加入100 ml去离子水，0.112MPa高压灭菌30分钟，置于4℃保存，使用前充分熔化，置于40－45℃水浴备用;2×培养基的配置：10gMEM干粉培养基、45ml注射用水、胎牛血清20ml、0.238克的HEPES、0.06克的L-谷氨酰氨，1克的水解乳蛋白、3％碳酸氢的2ml 、0.5％中性红 1.2ml配制而成，pH值调至7.3;使用时需将预先高压灭菌好的胶溶液与2×培养基1：1混合，待混合胶溶液降至37℃左右覆盖细胞。

本发明构思将1×培养基（培养细胞常规液体）、（2～10）×培养基分别与低熔点胶混合，在初始细胞数量相等的情况下在细胞表面覆盖低熔点胶培养细胞；和在初始细胞数量相等的情况下同时接种等量稀释的病毒后覆盖低熔点胶培养病毒,进行细胞计数和毒价测定，结果表明前者可有效提高单位面积的细胞数量和单克隆和纯化病毒粒子的数量，简单实用，达到了设计要求。

发明内容

本发明的目的在于：提供的用于病毒噬斑纯化和克隆混合胶溶液配制的新方法，替代（2～10）×培养基用于病毒噬斑、纯化和（细胞）克隆常规方法。

本发明是这样实现的：一种用于病毒噬斑纯化和克隆混合胶溶液配制的新方法，包括1×细胞培养基的制备、低熔点胶的制备、混合胶溶液的制备与铺胶；

其中1×细胞培养基的制备：由4-6克MEM干粉培养基，0.02-0.04克的L-谷氨酰氨，0.4-0.6克的水解乳蛋白，94-98ml注射用水和胎牛血清3-5ml混合均匀，pH值调至7.2-7.3备用；

其中低熔点胶的制备：取0.6克的低熔点胶粉，倒入三角瓶中，加入40ml去离子水，将瓶口用硫酸纸和牛皮纸扎紧，在微波炉上煮沸4min，呈半固体状时备用；

其中含1%的低熔点胶的混合胶溶液的制备与铺胶：

将上步的1×细胞培养基，加温38℃，取60ml与上步制备的全量低熔点胶混合均匀，用无菌的吸管轻轻吹打，使胶充分溶解并无气泡产生；取出预先制备好的培养成单层并接种产生细胞病变的病毒，即为原代细胞和传代细胞的细胞板；用移液器将细胞板里的培养基吸尽，然后将制备的胶溶液吸出，沿培养板壁将胶缓缓铺在细胞表面，铺完后在室温放置10min使其充分凝固，然后放入37℃、5%的CO₂培养箱中培养，观察细胞病变3-5天，挑取单个病毒克隆。

所述的方法，能使常规的细胞数量提高了1.5倍，使单克隆病毒传3代后的毒价提高了8.6倍（以10为底数）。

本发明的新方法，使用1×培养基方法培养细胞每孔细胞数量为8.5×10⁵是常规方法（细胞数为5.6×10⁵ ）的1.5倍，用1×培养基方法克隆出的病毒TCID₅₀的平均值为10^7.2；而用2×培养基方法克隆出的病毒TCID₅₀的平均值为10^6.55，前者是后者的3.55倍；该方法不仅提高了细胞的数量，同时提高了单克隆病毒的毒价，简化了程序，缩短时间，彰显技术进步。

具体实施方式

下面将结合实施例对发明作进一步说明。

采用1×培养基与低熔点胶混合进行病毒的克隆和纯化；

其中细胞的制备（以Marc-145细胞为例）：