[发明专利]一种大电流筛选大肠杆菌育种的方法

说明书

技术领域：

本发明属于微生物育种领域，涉及提高大肠杆菌BL21生长量的方法，具体是通过控制直流电的电流大小，筛选出对大电流具有耐受性的菌株，使其在无电流压力的情况下提高生长量，并且使这种生长优势能够保持多代。

技术背景：

电场对细胞生长及代谢的影响是生物化工、生物医药以及环境工程的重要研究课题，引起众多研究者的关注。微生物细胞的电解刺激技术已在酵母发酵体系、生物脱氮体系、有机废水降解体系等领域中得到初步应用，在工业微生物培养和环境修复电刺激方面显示出良好的应用前景。一般认为小电流能够促进微生物的生长，而大电流对微生物细胞施加负面影响，对微生物起到杀菌的作用。所以，电解刺激技术中多使用小电流促进微生物生长，而大电流多用于食品杀菌、保存以及某些加工过程。然而极端环境下存活的微生物在撤销环境压力后可以得到某些遗传特性，但是利用大电流筛选微生物以提高微生物生长量的研究却未见报道。

据《生物化学与生物物理学报》2001，33(1)报道，高翔等利用高压力诱变大肠杆菌TG1、DH5αP和HB101P得到了耐压的突变菌株TG1P、DH5αP和HB101P，使其在220MPa高压下的存活率提高了2～3个数量级。

据《现代生物医学进展》2006，6(4)报道，朱传合等利用微波诱变阿维拉霉素产生菌SV获得1株阿拉维霉素的突变菌株SV-15，产量达到21.5mg/L，较出发菌提高119.4％。

据《Bioresource Technology》2007，98(18)报道，Walid A Lotfy等利用紫外线柠檬酸产生菌Aspergilbus-niger UMIP2564获得成品收率达到60.25％的变异菌株W5。

据《微生物学通报》2010.37(10)报道，本实验室孙西同等通过小电流刺激大肠杆菌，提高了大肠杆菌的生长量。但小电流刺激的大肠杆菌必须在通电情况下才能表现出生长优势，一旦取消通电，其生长优势很快消失。

发明内容：

本发明目的是针对具有清楚遗传背景的大肠杆菌进行大电流筛选得到耐受菌株，撤销电流压力后，使获得的大肠杆菌更具有生长优势，并且使这一优势能够保持3～4代。

本发明在小电流筛选大肠杆菌的基础上，利用大电流筛选大肠杆菌，撤销电流后获得的大肠杆菌生长量增加，并且使这种生长优势能够保持多代。

利用大电流筛选大肠杆菌的方法，需要选择合适的电极、电流，并且控制电流大小使其维持恒定。

一种大电流筛选大肠杆菌育种的方法，选择在大电流环境中仍能存活的耐受菌株，撤销电流压力后，提高大肠杆菌的生长量，并且使得这种生长优势能够保持多代，其特征是选择Yi-Ti或者Pt做电极，并且使阴极、阳极之间保持0.5～10cm的距离。将大肠杆菌种子液置于50～130mA的大电流环境中培养8～24h，划板，25℃～40℃恒温培养12～96h。

与现有微生物育种的方法相比，该方法具有能够保持多代生长优势，简单易操作，清洁无污染的特点。

附图说明

图1经100mA直流电筛选后的大肠杆菌生长曲线。

图2经110mA直流电筛选后的大肠杆菌生长曲线。

具体实施方式

实例1：选用通用的模式菌大肠杆菌BL21，施加100mA直流电作用于大肠杆菌BL21，筛选出大电流耐受菌株BL21E100

1.1种子培养：取50μL甘油保存菌种，接入250mL装有100mL培养基的锥形瓶中，30℃，130r/min水浴摇床培养18小时。

1.2诱变培养：取4mL种子液于装有300mL培养基的三口玻璃电解瓶中，Yi-Ti电极做为阴极；Pt电极做为阳极，控制电流大小保持100mA恒定，并且使大肠杆菌在电场环境中持续培养24小时。划板，37℃恒温箱培养48h，获得大电流耐受菌BL21E100。

1.3100mA直流电筛选后的大肠杆菌的生长量检测

经100mA直流电处理后的大肠杆菌，用生长曲线表示其生长情况，如图1所示，发现18hBL21E100较原菌的生长量提高最大，ΔOD＝0.221。然后用干重表示大肠杆菌的生长量，如表1所示，发现和原菌比较，BL21E100的生长量优势保持了4代，其中第一代增长率最大，比原菌提高了36.8％。

实例2：施加110mA直流电作用于大肠杆菌BL21，筛选出大电流耐受菌株BL21E110

1.1种子培养：取50μL甘油保存菌种，接入250mL装有100mL培养基的锥形瓶中，30℃，130r/min水浴摇床培养18小时。