[发明专利]一次性同时定量测定多种抗生素的方法

权利要求书

1.一次性同时定量测定多种抗生素的方法，包括：

(1)将样品提取液以1滴/s的速度经过固相萃取柱，待上清液完全流出后，依次用2-8mL水和2-8mL体积浓度为5％的甲醇水溶液淋洗，弃去全部流出液；然后将上述的固相萃取柱减压抽干2-8min，再用8-12mL体积浓度为10％的甲醇乙酸乙酯溶液洗脱，将洗脱液在35-45℃吹氮气，浓缩至干得残渣，用1mL标准溶解液溶解所述的残渣后过0.45μm滤膜，得样品滤液；

(2)液相色谱条件为：色谱柱Inertsil ODS-3，流速0.4mL/min，检测波长：265nm；进样量10μl，流动相为乙腈和体积浓度为0.2％甲酸水溶液，得液相色谱图；其中洗脱梯度为0min时，乙腈的体积比为40％，其余为体积浓度为0.2％的甲酸水溶液；8min时，乙腈的体积比为60％，其余为体积浓度为0.2％的甲酸水溶液；10min时，乙腈的体积比为60％，其余为体积浓度为0.2％的甲酸水溶液；25min时，乙腈的体积比为40％，其余为体积浓度为0.2％的甲酸水溶液；30min时，乙腈的体积比为40％，其余为体积浓度为0.2％的甲酸水溶液；

质谱条件：离子化方式为电喷雾电离源正源模式，离子源温度320℃，喷雾电压3000V，氮气流量10ml/min，得质谱图；

(3)用上述的液相色谱条件和质谱条件测定步骤(1)中制备的样品滤液，根据从质谱图中提取的单个抗生素离子流图，读出不同时间间隔内的出峰面积，根据标准曲线求出对应抗生素的浓度；然后通过液相色谱图中的出峰面积与标准品的出峰面积比照，确定抗生素的种类，最后对获得的数据进行处理，得出样品中各种抗生素的含量。

2.根据权利要求1所述的一次性同时定量测定多种抗生素的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的样品提取液的制备方法为：

a粪便样品：将1g粪便样品冷冻干燥12-24h，然后粉碎至粒径0.30mm后，加入到10ml pH值为4.7的乙腈中，混匀后，25℃超声15min，4000r/min离心15min，再重复提取两次，收集上清液；将所得上清液通过纤维膜过滤得滤液，然后将所得滤液分别用10mL正己烷萃取两次，将萃取液旋干后再用双蒸水稀释，最后用纤维膜过滤，即得粪便样品提取液；

b土壤样品：将1g土壤样品冷冻干燥12-24h，然后粉碎至粒径0.30mm后，加入20mL的EDTA-McIlvaine缓冲溶液，振荡30min，取上层提取液，反复提取3次后，合并3次提取液，最后将所得提取液用玻璃纤维膜过滤，即得土壤样品提取液；

c水样：用滤膜除去水样的悬浮物，然后按1L水样中加入0.5mg Na₂EDTA，再加入盐酸调节pH值至3.0，即得水样提取液。

3.根据权利要求2所述的一次性同时定量测定多种抗生素的方法，其特征在于：a中所述的pH值为4.7的乙腈是经柠檬酸缓冲液酸化制得，其中柠檬酸缓冲液是将浓度为0.1moL/L的柠檬酸钠溶液和0.1moL/L柠檬酸溶液按照体积比1.4∶18.6混和制得。

4.根据权利要求2所述的一次性同时定量测定多种抗生素的方法，其特征在于：a和b所述的纤维膜均为玻璃纤维膜。

5.根据权利要求2所述的一次性同时定量测定多种抗生素的方法，其特征在于：b中所述的EDTA-McIlvaine缓冲溶液的制备方法为：将浓度为0.2moL/L的柠檬酸溶液和浓度为0.2moL/L的Na₂HPO₄溶液按照体积比8∶5混合，配制成McIlvaine溶液，然后取1L所述的McIlvaine溶液加入37.2g Na₂EDTA，即得0.1moL/L EDTA-McIlvaine缓冲溶液。

6.根据权利要求1所述的一次性同时定量测定多种抗生素的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的固相萃取柱为PEP固相萃取柱，且预先经5mL甲醇和5mL水活化；所述的标准物质为四环素，氯霉素，土霉素，磺胺嘧啶，磺胺二甲嘧啶，磺胺甲噁唑。

7.根据权利要求1所述的一次性同时定量测定多种抗生素的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的标准溶解液是由0.4mL甲醇和0.6mL去离子水混合制得的。