[发明专利]一种增加龟裂链霉菌的土霉素产量的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及一种增加龟裂链霉菌的土霉素产量的方法。

背景技术

微生物可对其产生抗性的抗生素现在已涵盖了我们所已知的绝大多数种类自然的或者合成的化合物。抗生素产生菌都含有能抵御自身产生的抗生素的抗性元件，这些元件大多位于抗生素生物合成基因簇，属于调控元件。环境中抗生素的存在使微生物在不生产最初抗生素的情况下也能从相近种属中获得或自主进化得到高特异性的抗性元件。因此，对于抗性基因的研究一直是人们的兴趣所在，尤其是抗生素产生菌的自我抗性机制。

要想对抗生素的自我抗性机制有详细深入的了解，先要清楚不同的抗生素在细胞内的作用位点。抗生素的作用机理大致有以下几种：1)，对细胞壁的形成有抑制作用，如青霉素，头孢菌素，磷霉素等；2)，影响细胞膜的功能，如多肽类抗生素；3)，抑制蛋白质合成，如红霉素，链霉素等；4)，干扰核酸代谢，如丝裂霉素，灰黄霉素等。对于作用于不同位置的抗生素，细胞采取了不同的抵御方式。

如前所述，抗生素产生菌自我保护机制可以细化到许多种类，大多数生产菌不是单一采用一种机制，而是几种机制共同起作用。龟裂链霉菌就是采用抗生素作用靶点的修饰和药物溢流两种方式来保护自身，免受土霉素(OTC)侵害，后者同时也是降低终产物抑制的有效手段。

然而，为了提高土霉素的产量，本领域还有必要进一步研究保护龟裂链霉菌自身，提高土霉素产量的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种增加龟裂链霉菌的土霉素产量的方法。

在本发明的第一方面，提供一种增加龟裂链霉菌的土霉素产量的方法，所述方法包括：在龟裂链霉菌中增加土霉素抗性基因otrA或otrB的表达。

在另一优选例中，在龟裂链霉菌中增加土霉素抗性基因otrB的表达。

在另一优选例中，在龟裂链霉菌中增加一个拷贝的土霉素抗性基因otrA或otrB。

在另一优选例中，所述方法包括：

(1)提供表达载体，所述表达载体中包含土霉素抗性基因otrA或otrB的序列；

(2)将表达载体转化龟裂链霉菌，选择基因组中整合有外源的土霉素抗性基因otrA或otrB序列的重组龟裂链霉菌。

在另一优选例中，所述的表达载体中，土霉素抗性基因otrA或otrB的序列的5’端，包括强启动子ermE。

在另一优选例中，所述的表达载体是pSET152载体。

在另一优选例中，步骤(2)中，将表达载体转化去甲基化菌株；从转化的菌株中提取去甲基化的表达载体转化龟裂链霉菌。

在本发明的另一方面，提供一种重组的龟裂链霉菌，其基因组中整合有外源的土霉素抗性基因otrA或otrB的序列。

在另一优选例中，所述的重组龟裂链霉菌是通过前面所述的方法制备获得。

在本发明的另一方面，提供一种生产土霉素的方法，所述方法包括：

培养所述的重组的龟裂链霉菌，从而生产土霉素。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、重组质粒pSET152-otrB。

图2、pSET152-otrB酶切鉴定图谱。Lane 1：分子量标记DL15000；Lane 2：NdeI消化的pSET152-otrB；Lane 3：XbaI&NdeI消化的pSET152-otrB。

图3、电击的转化子筛选平板。

图4、ET12567/pSET152-otrA、ET12567/pSET152-otrB转化子PCR鉴定。Lane1-7：otrA基因转入的重组菌株；Lane 8-9：阳性对照(PCR模板为空载pSET152质粒，带有apr)；Lane 10-16：otrB基因转入的重组菌株。Lane 17：分子量标记Marker III。

图5、重组菌株整合方式PCR鉴定图。A为整合otrA之后的重组菌株染色体示意图。B和C分别表示阳性重组菌株的PCR结果。

图6、平板实验筛选重组菌株。A为otrA基因增强重组菌株(SRI-A)；B为otrB基因增强重组菌株(SRI-B)。

图7、20株otrA和otrB增强重组菌株发酵结果。

具体实施方式