[发明专利]一种热稳定性改良的木聚糖酶xyn-CDBFV-m及其基因和应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种热稳定性改良的木聚糖酶xyn-CDBFV-m及其基因、包含该基因的重组载体和应用。

背景技术

木聚糖是一种五碳糖，是植物细胞中重要的结构多聚糖，在植物细胞壁中的含量仅次于纤维素，约占细胞干重的35％。木聚糖是半纤维素的重要组分，它是自然界中含量仅次于纤维素的第二丰富的多聚糖，几乎占地球可更新有机碳含量的三分之一。木聚糖也广泛存在于饲料原料中，如玉米、麦麸、米糠、秸秆、豆粕等。富含于饲料中的非淀粉多糖(Non-starch Polysaccharides，NSPs)是重要的抗营养因子，其中含量较高的木聚糖的抗营养作用主要表现为：木聚糖本身难以被单胃动物消化，同时结合大量的水，使采食动物消化道中食糜的体积增大、粘度增加、养分与消化道内源酶的作用降低，从而阻碍营养物质，尤其是脂肪和蛋白质的消化吸收，降低饲料的利用率。木聚糖酶是可将木聚糖降解成低聚糖或木糖的一类酶的总称，一般指内切β-1，4木聚糖酶。木聚糖酶可以有效地从木聚糖的主链内部作用于木糖苷键，将高分子量的木聚糖，降解为低分子量的低聚糖。研究结果表明，饲料中如果添加木聚糖酶，就可显著降低阿拉伯木聚糖分子大小，将其分解成较小聚合度的低聚木糖，从而改善饲料性能，消除或降低因粘度增加而引起的抗营养作用总而言之木聚糖酶可以破坏植物细胞壁结构，提高各种类型饲料的利用率；降解可溶性多糖，降低其粘性；减少畜禽肠道疾病；增进畜禽健康，提高成活率；减少粘粪，降低空气中氨气和硫化物浓度；减少粪便排出和脏蛋；使畜禽体重均匀；减少环境污染。因此，木聚糖酶在饲料资源开发和提高廉价副产品的利用率方面，具有广阔的应用前景。

和其他的酶制剂不同，用于饲料上的酶制剂，需要经历一个高温制粒的过程，因为在饲料制粒时的高温处理，可以将饲料转化率提高10％，料肉比提高；避免畜禽挑食，达到均衡营养；增大密度，仓储运输费用降低；流动性好，饲养方便；减少喂养过程、畜禽食料过程及自然环境造成的饲料损失；有效杀灭饲料中的沙门氏菌达到绿色饲料要求等优点。因此饲料用酶需要较好的热稳定性，能够抵御在制粒过程中的高温处理。虽然目前发现的木聚糖酶比较多，但能够直接应用于饲料的天然木聚糖酶却很少，在饲料行业的木聚糖酶需要具备一些特殊的性质，如好的热稳定性。大多数木聚糖酶在饲料制粒的过程中都会大幅度失活，因此耐高温的酶有更好的应用前景。来源于瘤胃真菌Neocallimastix patriciarum的木聚糖酶催化结构域xyn-CDBFV是一种性质优良的木聚糖酶(其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，基因序列如SEQ ID NO.4所示)，其表达量及pH活性特征都比较适合在单位动物体内发挥水解木聚糖的作用。但该酶不能抵御在制粒过程中的高温，在高温制粒的过程中有大量的酶失活，因此提高该木聚糖酶的热稳定性，使其能够有效地在饲料工业上应用。

目前通过蛋白质工程的手段在酶分子改造方面已经有很多成功的例子，特别是在提高酶的热稳定性。定点突变即理性设计是在已知酶的结构与功能的基础上有目的、有针对性地改变酶的某一活性基团或模块，最终获得特定氨基酸残基的具有性质得到预期改变的蛋白质，该技术已被广泛用于酶分子的改造。

发明内容

本发明的目的是通过对来源于瘤胃真菌Neocallimastix patriciarum的木聚糖酶的改造，使改造后的木聚糖酶xyn-CDBFV-m在高温时稳定性提高，能够抵御饲料高温制粒时由于温度过高造成酶蛋白的变性，使其能够更好的在饲料中内发挥水解木聚糖的作用。

本发明的目的是提供一种优化改良的木聚糖酶xyn-CDBFV-m及其基因。

本发明的再一目的是提供包含上述的木聚糖酶基因的重组载体。

本发明的再一目的是提供包含上述的木聚糖酶基因的重组菌株。

本发明的再一目的是提供上述木聚糖酶xyn-CDBFV-m的应用。

本发明的木聚糖酶xyn-CDBFV-m和原有木聚糖酶xyn-CDBFV相比，有16个氨基酸发生了突变或删除，突变位点分别是A33C，Y58C，N88P，P122T，D124T，W125S，V126L，D176E，以及第90，91和92位点删除，和第128到132位点删除。突变后的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：