[发明专利]一种去除蛋白制备过程中所使用离液剂的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种去除蛋白制备过程中所使用离液剂的方法。

背景技术

我国是乙型肝炎高发区，有50-70％的人群感染过乙型肝炎，10％的人群为带毒者。目前还没有有效的治疗方法，接种疫苗是预防肝炎的有效措施。1968年，美国科学家Prince等人在乙肝病人的血清中发现了特异存在的乙型肝炎病毒抗原成分，1971年Kongman又利用HbsAg阳性血清首次分离得到了HBsAg亚单位颗粒，1981年，利用慢性HBV携带者血清分离纯化得到的乙型肝炎血源疫苗正式被批准生产并用于人体免疫。

上世纪八十年代以来，基因工程技术的发展为新型乙肝疫苗的研究开辟了新途径。1986年，美国正式批准默克公司使用酿酒酵母菌生产的基因工程乙肝疫苗进入市场。随后，HBsAg在中华地鼠卵巢细胞(CHO)和汉逊酵母中也得到了成功的表达并纯化得到疫苗成品；近几年HBsAg在毕赤酵母中得以高表达量的表达并工业化的纯化。

酵母表达的HBsAg有一定的抗原性，可以通过抗原检测试剂盒进行测定，但是起始抗原其亚单位是通过非共价键结合在一起，其免疫原性还不足以用作乙肝疫苗。为了提高基因重组酵母表达的HbsAg的免疫原性，对其分子结构、特别是分子内和分子间二硫键的形成，及其对抗原性的影响进行了大量的研究，形成了用硫氰酸钾(KSCN)对HBsAg进行体外化学修饰的方法，大大提高了HBsAg的免疫原性。

酵母发酵表达的HBsAg通常经过高压均质机破菌、硅胶吸附抗原、分离硅胶、从硅胶上解离抗原、疏水层析纯化抗原，加KSCN处理抗原，再去除KSCN，而得到高纯度、活性稳定的抗原用于制造乙型肝炎疫苗。所使用的KSCN是一种离液剂，有一定的毒性，在乙肝疫苗的制备中相当于变性剂，它能破坏蛋白质等大分子的三级结构的维持力，如氢键、范德华力和疏水相互作用。蛋白质经过KSCN这种变性剂作用后必须要去除变性剂才能恢复其天然构象，具有天然构象的蛋白质才能发挥其最佳的天然功能。

在核酸和蛋白制备过程中，通常会使用离液剂，例如硫氰酸钾等，目前已知去除离液剂的方法有超滤、透析或脱盐柱脱盐。以HBsAg为例，用超滤的方法纯化HBsAg时，通常采用的超滤膜的截留分子量是300KD或500KD，收集得到的是分子量大于300KD或500KD的所有物质，包括HBsAg及其聚集体，只能去除分子量小于300KD或500KD的杂质，包括KSCN和小分子量的杂蛋白，而且超滤过程中抗原颗粒容易形成聚集体，而超滤并不能分离抗原颗粒形成的聚集体。透析所采用的透析袋的截留分子量通常为3000，虽然经过多次换透析缓冲液可以比较彻底的去除KSCN，但是其不适于大规模生产操作，也不能去除杂质蛋白。

因此，还有待开发新的方法来简便、有效地去除蛋白制备生产过程中使用的离液剂。

发明内容

因此，本发明的目的是提供一种去除蛋白制备过程中所使用离液剂的方法。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的。一方面，本发明提供了一种去除蛋白制备过程中所使用离液剂的方法，所述方法采用分子筛层析来去除离液剂。

优选地，所述分子筛选自交联琼脂糖凝胶或交联葡聚糖凝胶。

优选地，所述分子筛为Sepharose 4FF、Sepharose 6FF、Sepharose 4B、Sepharose 2B、Sephacryl S-400HR、Sephacryl S-500HR、Sephacryl S-1000SF、Sepharose CL 4B或Sepharose CL 2B，更优选为Sepharose 4FF。

优选地，所述离液剂选自硫氰酸钾、硫氰酸钠、硫氰酸锂、尿素或盐酸胍。

优选地，所述分子筛层析的平衡缓冲液pH值为6～9，其中含有0.15MNaCl。

优选地，所述缓冲液选自磷酸盐、Tris-HCl、碳酸盐、硼酸盐、柠檬酸盐或MOPS缓冲液。

另一方面，本发明还提供了一种乙肝疫苗的制备方法，所述方法包括上述的方法来去除乙肝疫苗制备过程中所使用的离液剂的步骤。

优选地，所述方法包括采用分子筛Sepharose 4FF层析来去除乙肝疫苗制备过程中所使用的硫氰酸钾的步骤。

优选地，所述分子筛Sepharose 4FF层析的平衡缓冲液为10～50mM磷酸盐缓冲液，pH值为6.0～9.0，其中含有0.15M NaCl。