[发明专利]一种优化的涂抹除草剂筛选转基因作物的方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物转基因技术领域，具体地是一种优化的涂抹除草剂筛选转基因作物的方法。

背景技术

将人工分离或修饰过的基因导入到生物体基因组上，由于外源基因的表达使生物体的性状发生可遗传的改变，这一技术称之为转基因技术。转基因技术的发展打破了物种隔离，能够将具有优良性状的目的基因导入到植物基因组中，从而使得许多植物的遗传性状得到改良。在转基因的操作过程中，只有少数外源的DNA能够转入到植物细胞内，进一步整合到植物基因组DNA上，还有大多数的植物细胞是没有被外源DNA转染，如何剔除这些未转基因的植物细胞是转基因技术的核心问题之一。目前一般利用选择标记基因辅助目的转基因的筛选。在目的基因转化时引入选择标记基因，赋予受体植物特定的筛选标记，以便于在数目庞大的植物转化后代中简便快速地筛选得到转基因阳性植株。

抗生素是现在广泛使用的一种选择标记。大多数抗生素抗性基因作为植物筛选的标记基因，最常使用的有新霉素磷酸转移酶基因（NptII）和潮霉素磷酸转移酶（HPT）基因，前者基因编码的酶使其转基因植物具有卡那霉素和新霉素抗性，而后者基因编码的酶则赋予转化受体潮霉素抗性。虽然抗生素抗性基因作为筛选标记基因有筛选方便和转化效率高等优点，但是这些抗性抗生素抗性如果转移到微生物特别是病原菌里，将使病原菌产生抗生素抗性，对人类的健康产生安全隐患。另一方面，抗生素的价格昂贵，作为大规模的转基因作物产业化生产来说成本太高。这两方面的因素决定了抗生素抗性基因在转基因产业化筛选方面的应用受到限制。除草剂是近几年发展起来的一种筛选标记，最常用的除草剂是草甘膦和草丁膦。抗除草剂基因不仅作为筛选标记基因还是一种目的基因，利用除草剂作为筛选剂使转基因作物在具有目标性状的同时还能具有除草剂抗性。另一方面，除草剂的价格便宜，可以大大降低转基因作物产业化的成本。但是除草剂作为一种新兴的筛选标记，其操作体系尚不成熟。大田使用除草剂一般用喷洒的方式来杀死杂草，这是一种高选择压的使用方式，对于T0代转基因阳性苗的筛选显然不合适。因为过高的选择压可能杀死一些转基因阳性苗。另一方面，目前许多农作物转化用的活体转基因技术，T0代为嵌合体，喷洒法会杀死绝大多数的T0代植株，导致转基因的失败。因此，摸索一套切实可行的筛选方法对于除草剂选择标记的推广使用具有比较重要的实际应用价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种优化的涂抹除草剂筛选转基因作物的方法，包括以下步骤：

（a）在T0代转基因农作物的新生的第3~5叶片上，用marker笔标记直径约1cm的圆圈。

（b）用移液器吸取2ul的除草剂溶液点在圆圈的中心。

（c）5~7天后，经除草剂处理的有一片或以上叶片表现正常的植株为转基因阳性植株。

（d）将上述筛选得到的转基因阳性植株移栽到大棚里，收种。

本发明中T0代转基因农作物是指用植物活体为受体，将携带除草剂基因或者携带除草剂选择标记基因的表达载体转化农作物得到的T0代转基因植株。以植物活体为外植体转化得到的T0代转基因植株为嵌合体，常规的除草剂喷洒筛选方法会把嵌合体杀死，发明人大量的实验结果证明本发明提供的涂抹筛选方法能够高效、简便地筛选得到T0代转基因阳性植株。

在除草剂筛选过程中，为了使除草剂溶液均匀附着在作物叶片的表面，本发明人在除草剂溶液中添加了表面活性剂，通过实验证明在除草剂制剂按照比例稀释在0.02%的silwet-L77水溶液中筛选效果最好。

本发明中所述的除草剂是任一可以作为植物筛选标记的除草剂，优选为草甘膦和草丁膦。本发明中所述的作物为大豆、小麦、玉米、水稻或高粱的野生或栽培品种、品系、育种材料或中间材料。

为了便于理解，下面将结合附图和实施例进一步诠释本发明。具体实例和附图仅是为了更好的阐述本发明，并不构成对本发明范围的限制。显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。

附图说明

图1为T0代转基因大豆草胺磷涂抹实验筛选结果示图，其中A图为野生型，B图为转基因阳性植株。红色圆圈为草胺磷涂抹的叶片部位。