[发明专利]双温快循环荧光定量PCR端粒酶活性的检测方法和试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种双温快循环荧光定量PCR端粒酶活性的检测方法和试剂盒。该方法应用锚定发夹引物(Anchored hairpin structural primer，AHP)及复合式蝎形引物(Duplex scorpion primer，DS)，在荧光定量PCR仪上，采用双温快循环PCR扩增条件，进行端粒酶活性的检测。即为用DS/AHP-TRAP(锚定发夹引物及复合式蝎形引物-端粒重复序列扩增分析法)检测端粒酶活性的试剂盒。

背景技术

端粒酶(Telomerase)是广谱肿瘤标志物，它在近90％的癌症中都有高频率的表达，而良性、癌前病变以及癌周围的组织中，一般无表达。端粒酶活性的测定具有直接性、高敏感性和强特异性，可作为一个独立的恶性肿瘤早期诊断、治疗监测和预后判断的指标。而且作为分子诊断手段，端粒酶活性检测明显优于肿瘤临床病理分期、组织学分型或细胞分化程度等现有细胞学诊断技术。它尤其对筛查或诊断无症状的早期癌症，具有特殊的价值；对于那些形态学上良恶性难以鉴别的肿瘤，是判断肿瘤恶性程度有用的指标；作为肝细胞癌切除术后复发的独立预测指标，可预测肝癌术后转移复发。另一方面，端粒酶也是肿瘤治疗的最佳靶点之一，由于端粒酶在肿瘤细胞与正常体细胞之间的差别，端粒酶抑制剂可减少对机体的毒副作用。因此，抗端粒酶疗法已成为肿瘤治疗的一种新方法。围绕端粒酶抑制剂的研究也在如火如荼地进行着，而端粒酶活性测定则是评价药物的重要指标。总之，端粒酶活性的测定可用于癌症早期诊断、癌症预后、癌症的基因治疗和抗癌药物研发等各个领域。因此，采用现代分子生物学技术，研究开发端粒酶活性检测的新方法，为肿瘤防治提供技术上的保障，加速临床应用的进程，是十分必要的。

检测端粒酶活性的标准方法是端粒重复序列扩增分析法(telomeric repeat amplification protocol，TRAP，Kim N.W.，Piatyszek M.A.，Prowse K.R.，Harley C.B.，West M.D.，Ho P.L.C.，Coviello G.M.，Wright W.E.，Weinrich S.L.，Shay J.W.，Science，1994，266，2011-2015)。该法主要分为三个步骤：1)延伸阶段，底物在端粒酶的作用下延伸，其3′-端加入若干TTAGGG的重复序列；2)PCR扩增阶段，端粒酶延伸产物扩增数百万倍以上；3)产物的检测阶段。TRAP法巧妙地将PCR技术应用于端粒酶活性检测中，极大地提高了检测的灵敏度，

与常规的PCR扩增不同，TRAP方法检测的不是样本中核酸的量，而是端粒酶活性。因此在PCR扩增之前，端粒酶首先对底物进行延伸，产生端粒酶延伸产物，随后通过对端粒酶延伸产物的扩增，达到检测端粒酶活性的目的。TRAP法的模板分子——端粒酶延伸产物序列很特殊，由底物序列和多个不等的端粒重复序列组成。因此，在以底物序列为正向引物的TRAP法中，反向引物CX设计为有三个错配碱基的端粒重复序列的互补序列。然而由于端粒酶延伸产物含有多个端粒重复序列，因此，在PCR反应的每一轮循环时，它仍可结合在端粒重复序列的任意部位，甚至在同一时间同一条模板分子上都可能会有多于一个的CX引物开始延伸。这导致了TRAP法得到的PCR产物的个数与端粒酶延伸产物不完全一致。从而干扰检测结果。

改进PCR反向引物的新方法，如CX-ext、CXa引物、锚定引物ACX、发夹型引物以及双反向引物-TRAP法等，均极大地减少了副产物的生成。其中锚定引物在5′-末端加入了一段与端粒序列无关的锚定序列，使得PCR产物5′-末端被非端粒序列封闭，阻止端粒酶产物在此端的延伸。从而避免了假阳性结果的出现，因而得到广泛的应用。但是该方法在不进行热启动时，会有非特异性产物生成。除此之外，TRAP法尚有许多常规PCR的不足之处，如终点检测结果，因此，劳动强度大、定量不准确、重现性差；同时，在测定PCR扩增产物前须打开反应管，易造成污染。因此，难以满足临床应用的要求。

荧光定量PCR技术巧妙地将PCR扩增、荧光探针杂交和光学检测结合于一体，通过微机控制，对PCR每一轮循环进行实时监测，并自动报告分析结果。该技术操作简单、安全、自动化程度高。不需要PCR后处理，从而从根本上解决了产物污染而导致的假阳性问题。而且特异性、灵敏度和重现性显著提高。同时，由于在PCR扩增的指数期(原始模板以相对固定的指数形式增长)进行定量检测，从而真正在技术上实现了PCR从定性到定量的飞跃。