[发明专利]半滑舌鳎抗菌肽hepcidin的重组表达及其应用

说明书

技术领域

本发明属于抗菌重组蛋白技术领域，具体涉及一种半滑舌鳎抗菌肽hepcidin的重组表达及其应用。

背景技术

海水养殖品种生活于富含各种微生物的水环境中，长期的生存适应使其形成了有效的防卫功能，而其中抗菌肽作为是鱼、虾、贝类等动物非特异性免疫防御系统的重要成分之一，在防御海洋性细菌和病毒入侵方面起着重要作用。抗菌肽(antimicrobial peptides)是一类具有很强的广谱抗菌的天然小肽类物质，自1975年瑞典科学家Boman等从蚕蛹身上分离得到第一个抗菌肽天蚕素(Cecropin)以来，人们又在细菌、真菌、植物、无脊椎动物以及脊椎动物中发现了至少900余种抗菌肽。抗菌肽具有抗菌谱广、杀菌活力高、作用迅速、不产生耐药性等特点。

Hepcidin(HEPC，HAMP)是近年来发现的一类由肝脏合成的、富含半胱氨酸的抗菌肽，是β-defensin蛋白家族中的一员(Verga F，et al，Gene.205，364：37-44)。2000年，Krause等(Krause A，et al，FEBS Lett，2002，480：147-150)首先从人血液中分离纯化得到了这一多肽，将其称之为肝脏表达的抗菌多肽(liver expressed antimicrobial peptide，LEAP-1)。2001年，Park等从人尿中也分离到这一多肽，并将其命名为hepcidin(Park C H，et al，J Biol Chem，2001，276：7806-7810)。研究证明，不同种属来源的hepcidin抗菌肽家族在成熟肽同一位点上含有典型特征的八个半胱氨酸残基的保守序列，有抗各种真菌和革兰氏阳性、阴性菌的活性。目前，在鱼类、两栖类、鸟类、哺乳类中都有hepcidin基因的发现。鱼类hepcidin是2002年发现的，由Shiker等首次报道从杂交斑纹鲈鱼(Morone chrysops×M.saxatilis)的鳃中分离得到其成熟肽片段(Shiker H，etal，Eur J Biochem，2002，269：2232-2237)，其肽序列与人的hepcidin同源，成熟肽由21个氨基酸残基组成，含8个半胱氨酸，形成4个分子内二硫键，具有广谱抗菌活性。

抗菌肽的抗菌功效显著，应用前景很广泛，但是由于天然抗菌肽的含量很低，无法大量提取，化学合成价格昂贵，限制了抗菌肽的广泛应用。近年来海水养殖业中抗生素的大量应用，一方面造成水产品中含有过量违禁的抗生素药品，产品质量下降，另一方面引起致病菌的抗药性，养殖环境恶化，已严重影响到水产业的健康发展。与抗生素不同的是，抗菌肽的靶位点主要是病原体细胞膜，不易产生抗性，而且对真核细胞几乎没有作用。抗菌肽在海水养殖鱼类的疾病防治上将是一种应用前景广阔的抗菌药物。因此，利用基因功能技术生产具有高效杀菌效果的抗菌肽，并应用于水产养殖业以及各种禽畜动物的饲养中，已成为我国水产养殖业和畜牧业的必然选择。

原核E.coli表达系统以培养方便，周期短，遗传背景清楚，发酵成本低廉等特点，成为基因功能产业化中的理想表达系统。但是抗菌肽由于分子量小，碱性氨基酸多，在水溶液中以自由卷曲形式存在，易被蛋白酶降解，而且大多数抗菌肽对宿主本身有毒害作用，同时表达后的蛋白纯化及复性过程复杂难以操作，这些因素均限制了抗菌肽重组蛋白的大规模生产及应用。因此，构建合适的融合表达载体，并筛选大量表达且有活性的抗菌肽工程菌株，简化纯化过程，降低生产成本，以实现大规模生产并应用于水产养殖业和畜牧业中，已成为目前研究人员的关注热点之一。

发明内容

本发明的目的是提供一种半滑舌鳎抗菌肽hepcidin的重组表达及其应用，针对现有技术中抗菌肽合成工序复杂、成本高、不易大规模生产的不足，利用克隆得到的半滑舌鳎抗菌肽hepcidin成熟肽的基因序列，构建原核表达载体，从而获得大量且有活性的抗菌肽，应用于水生生物或禽畜动物养殖中，或作为抗生素的替代品用于生物的病害防治，细菌性甚至病毒性疾病的防治。

本发明技术方案如下：

一种重组表达载体，其特征在于，所述的表达载体用于表达序列为SEQ IDNO：1的半滑舌鳎抗菌肽hepcidin。

所述的表达载体中插入了用于重组表达序列为SEQ ID NO：1的半滑舌鳎抗菌肽hepcidin的核苷酸片段。

所述的核苷酸片段的序列为SEQ ID NO：2。

为了减少促进重组蛋白二硫键形成，本发明的表达载体优选为原核表达载体pET32a(+)。