[发明专利]玫瑰再生为完整植株的方法

说明书

技术领域

本发明属于植物组织培养技术领域，具体的说是一种玫瑰再生为完整植株的方法。

背景技术

玫瑰(Rosa rugosa)是蔷薇科(Rosaceae)蔷薇属(Rosa)落叶直立丛生灌木，原产中国北部，其色艳花香，含油量高，是我国重要的经济植物，也是世界上重要的观赏与生产两型花卉之一。玫瑰采用传统的杂交育种的方法选育新品种，周期长，工作量大，并且会受到育种材料自身变异的限制，改良幅度有限，远远不能满足市场的需求。随着生物技术的快速发展，植物细胞工程和基因工程技术日趋成熟，可以在保持品种的其他性状相对稳定的基础上，利用外源基因对其所控制的性状进行定向改良，提高了育种的效率。玫瑰再生体系的建立是遗传转化体系建立的基础，也是利用基因工程育种的重要基础。植物体细胞胚发生途径(somatic embryogenesis)，是指植物在离体培养条件下，双倍或单倍的体细胞未经性细胞融合而通过与合子胚发生类似的途径发育成新个体的形态发生过程。

国内外关于玫瑰再生方面的报道较少，主要是利用玫瑰种子为外植体，通过诱导体细胞胚获得再生植株的。Kunitake等(1993)和Kim等(2009)分别以玫瑰未成熟种子和成熟种子为外植建立了体细胞胚再生体系。利用种子作为外植体进行植株再生，一方面无法很好的保持母株的优良性状，另一方面，种子的采集也受到时间和气候条件的限制。而叶片采集简单，也可以很好的保持母株的优良性状，因此，叶片为外植体再生对于玫瑰再生体系的建立，种质改良以及新品种选育具有重大的意义。但是至今尚未见到以玫瑰叶片为外植体材料建立再生体系的报道。

华中农业大学的专利申请“以叶片为外植体的月季再生植株的方法”(201010256892.3)，提出以月季未成熟叶片为外植体，通过体细胞胚发生途径，建立月季再生体系的方法，提出了以体细胞培养再生植株的概念。

虽然月季和玫瑰同属蔷薇科蔷薇属，但是对于植物组织培养技术领域而言，即使同属的植物之间，利用叶片为外植体进行体细胞培养再生植株时，受培养过程、培养基、控制条件不同，以及受体材料品种自身的特性影响，对其能否成功培养出再生植株，以及萌发率都有极大影响。因此，有必要针对以玫瑰叶片为外植体材料建立再生体系进行进一步的研究和实验。

发明内容

本发明的目的是为了解决上述技术问题，提供一种玫瑰叶片为外植体的玫瑰再生为完整植株的方法。该方法培育周期短，成活率高，增殖倍数高，能够完全保持母株性状，获得的体细胞胚便于长期保存，是遗传转化的重要受体材料。

技术方案包括以下步骤：

1)玫瑰无菌苗获得：将玫瑰的茎段灭菌后再切成1-2cm的带芽茎段，接种于继代培养基上进行初代培养得到玫瑰的无菌苗，然后在增殖培养基上进行增殖和继代；

2)体细胞胚诱导：切取继代培养的玫瑰无菌苗的未展开小叶，将其接种于体细胞胚诱导培养基，在黑暗条件下培养，直接诱导出体细胞胚；

3)体细胞胚增殖培养：诱导出的体细胞胚接种于体细胞胚增殖培养基，在弱光条件下，进行体细胞胚的增殖和进一步分化，得到成熟体细胞胚；

4)体细胞胚萌发成苗：将得到的成熟体细胞胚接种于体细胞胚萌发成苗培养基，在正常光照条件下，使其再生出植株；

其中，

初代培养基和无菌苗增殖培养基为：MS基本培养基，6-BA0.5mg/L，NAA，0.01mg/L，琼脂7.5g/L和葡萄糖30g/L，加蒸馏水至1L，pH 6.0；

所述体细胞胚诱导培养基成份如下：MS基本培养基，2，4-D3-4mg/L，葡萄糖30g/L，植物凝胶3g/L，加蒸馏水至1L，pH 6.0；

所述体细胞胚增殖培养基成份如下：MS基本培养基，2，4-D0-0.5mg/L，6-BA 0-0.05mg/L，CH1.0g/L，葡萄糖30g/L，植物凝胶3g/L，加蒸馏水至1L，pH 6.0；

所述体细胞胚萌发成苗培养基成份如下：1/2MS基本培养基或MS基本培养基，6-BA 0-0.4mg/L，葡萄糖30g/L，植物凝胶3g/L，加蒸馏水至1L，pH 6.0；

所述步骤3)的体细胞胚增殖培养阶段，光照强度为50-100lx，所述体细胞胚增殖培养基中的2，4-D为0.5mg/L，6-BA为0.01mg/L。

所述步骤4)中体细胚胞胚萌发成苗培养基中的6-BA为0.4mg/L，在体细胞胚萌发阶段，光照强度为1000-1500lx。

所述步骤2)得到的体细胞胚还可接种到体细胞继代培养基上，使其继代并保持分化能力。