[发明专利]一种甘蔗黑穗病抗性鉴定方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物抗病性鉴定技术领域，尤其涉及一种甘蔗黑穗病的抗性鉴定方法，还涉及到甘蔗黑粉菌的生理小种的鉴定方法。

背景技术

由甘蔗黑粉菌（U. scitaminea）引起的甘蔗黑穗病是一种世界性重要甘蔗病害，也是我国一种经济危害性最严重的甘蔗病害。防控该病害最经济最有效的方法是抗病育种，抗病育种的基础和关键是抗病性鉴定方法，即通过抗病性鉴定方法筛选出甘蔗黑穗病的高抗品种进行育种。我国现在普遍使用的甘蔗黑穗病抗性鉴定方法是利用人工采集的甘蔗黑粉菌混合冬孢子浸渍蔗芽进行甘蔗黑粉菌的接种，然后根据接种材料的黑穗病株发生率，对比黑穗病抗性分级标准（1～5级分类法）进行抗性分级，筛选出高抗的抗病品系以便于育种。该鉴定方法最大的优点是操作简单，经济实用，存在的问题是：

1、需要6个月以上， 鉴定历期长；

2、需采集大量黑粉菌冬孢子作为接种源，工作量大；

3、该方法使用的接种源为混合冬孢子，无法鉴别出参试品种抗感甘蔗黑穗病生理小种类型，从而不能有针对性的指导甘蔗抗黑穗病品种选育及蔗区甘蔗品种合理配置，影响了甘蔗抗黑穗病育种效率及病害防控效果。

因此，研究建立高效快速且能鉴别甘蔗黑穗病生理小种类型的甘蔗黑穗病抗性鉴定方法非常重用。

发明内容

本发明目的是针对现有甘蔗黑穗病抗性鉴定存在鉴定历期长、需冬孢子量大、不能鉴别参试品种生理小种类型等不足之处，提出一种甘蔗黑穗病抗性鉴定方法，该方法具有历时短、工作量小、高效快速的特点，还可鉴别参试品种抗感甘蔗黑穗病生理小种类型，优化甘蔗抗黑穗病的育种，提高甘蔗黑穗病防控效果。

本发明的目的通过以下技术方案来实现:一种甘蔗黑穗病抗性鉴定方法，其特征在于包括以下步骤：

步骤A、甘蔗黑粉菌异型交配型（+、-）单倍体担孢子的分离培养

A1．在无菌条件下，取3～10ug新鲜甘蔗黑粉菌冬孢子，用YEPS液体培养基充分稀释成50～100个甘蔗黑粉菌冬孢子/mL的稀释液。

A2．吸取100～200uL稀释液均匀涂板于YEPS固体培养基上，于28～30℃下培养2～3天，得到白色“羊毛状”单菌落。

A3.挑取1个白色“羊毛状”单菌落，用YEPS液体培养基充分稀释成50～100个担孢子/mL的稀释液，然后吸取100～200uL稀释液均匀涂板于YEPS固体培养基上，于28～30℃下培养2～3天，得到“酵母状”单菌落。

A4. 挑取10～15个“酵母状”单菌量菌液落分别于400～500uL的YEPS液体培养基中混匀，然后于28～30℃下振荡培养1～2天，得到OD₆₀₀值为1.0-1.5的菌液。

A5.将A4得到的各个菌液分别吸取1～2uL在YEPS固体培养基上一对一随机配合于28～30℃下培养2～3天，得到 “酵母状” 菌落和“羊毛状”菌落，“酵母状” 菌落为同型（+、+/-、-）交配型单倍体担孢子所形成，“羊毛状”菌落为异型交配型（+、-）单倍体担孢子形成；由此确定A4中至少一对异型交配型菌液。

步骤B、菌株扩大培养

取步骤A4中的一对异型交配型单倍体担孢子菌液，分别用YEPS液体培养基3～5mL于28～30℃扩大培养1～2天，得到OD₆₀₀值达1.0-1.2的2份菌液；

步骤C、接种

将步骤B培养得到的2份菌液等体积混匀；随后用注射器吸取20～30uL混合菌液，注射入事先种植好的甘蔗小苗生长点，接种甘蔗小苗20～30株/品种。

步骤D、发病率调查

将步骤C接种的甘蔗小苗置于25～30℃下生长，自第1株甘蔗发生黑穗病起，定期调查、记录甘蔗黑穗病发生株数，并将记录过的黑穗病发病株连根挖除，调查历期2～3个月，并计算每个参试品种的黑穗病株发生率。

步骤E、抗性评价

根据黑穗病抗性分级标准及参试品种的黑穗病株发生率，评价参试品种的黑穗病抗性水平及所抗感的甘蔗黑粉菌的生理小种。

YEPS液体培养基为酵母菌发酵常用培养基，主要成份为酵母粉（yeast）、蛋白胨(peptone)、蔗糖(sugar)和水，其比例通常为酵母粉10～20g/L、蛋白胨10～20g/L、蔗糖20～40g/L。关于YEPS培养基有如下报道：

食品科技2001年第二期中王岁楼等“某些添加物对红酵母生长及类胡萝卜素合成的影响”中所介绍的基础培养基（YEPS）：酵母粉1%、蛋白胨1%、蔗糖4%。