[发明专利]鉴别蔬菜叶螨种类的PCR方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物昆虫鉴别检测技术，特别是一种鉴别蔬菜叶螨种类的PCR方法。

背景技术

叶螨属于蜘蛛纲蜱螨亚纲真螨目叶螨科，俗称红蜘蛛，是农业生产上的重要害螨，为害寄主繁多，包括果树、蔬菜和棉花、小麦等重要农作物，其中在蔬菜寄主中，喜食茄子、菜豆、黄瓜、番茄等作物。叶螨以成螨和幼若螨聚集在植物叶片的背面进行刺吸为害，造成叶片上出现失绿斑点，严重时造成叶片干枯脱落，甚至整株死亡，极大地影响蔬菜的产量和品质。

害虫的种类鉴定在害虫防治中占有非常重要的地位，尤其是在叶螨这样的微型害螨中，存在的困难更多。传统鉴定方法中，许多叶螨都是根据雄性外生殖器的形态特征来进行鉴别的(Ehara，1999)。然而，由于叶螨是偏雌性比，因此田间采集到的多数试虫都是雌性叶螨。因此，为了鉴定叶螨的组成和种类，许多野外采集的叶螨试虫都必须在室内单头饲养到下一代，获得雄性个体，把雄性个体的外生殖器做成切片，待切片在烘箱内烘干之后，在显微镜下观察其形态特征，同时结合雌性成螨的体色进行鉴别。这样的传统鉴定方法费时较长，同时对于某些叶螨种类，其不同地理种群的外生殖器特征存在变异，因此，对于非分类专业的研究者来说，传统鉴定方法极其困难。

随着分子生物技术的发展，诸多文献提到采用DNA条码(DNA barcoding)可以解决种类鉴定这个问题(Hebert等，2003a，2003b；Tautz等，2002)。而且很多研究者由于其mtCOI基因的母系遗传及多态性的特性而采用该基因进行研究，多数是采用扩增测序mtCOI序列或者ITS2序列并与其它已登录在GenBank上的该基因序列构建系统进化树，分析样本与已知序列之间的同源性和遗传差异远近，进而推断出该基因的所属种类(Hinomoto等，2007；Vera等，2007；Tselila等，2007)。但是该技术也存在一些缺点和局限性，比如有些叶螨种类的序列在GenBank中未有登录，这样部分物种就得不到有效的聚类，因而无法进行准确分析；另外，该技术需要标本在PCR扩增之后进行测序，这样会耗费大量的时间和财力。因此，建立一套快速分子鉴定技术对于叶螨的各项基础研究和综合防治都是至关重要的前提和基础。

北方地区蔬菜上发生的叶螨种类主要有朱砂叶螨、二斑叶螨和截形叶螨，其中朱砂叶螨和截形叶螨均为红色体型，二斑叶螨通常为黄绿色体型，这三种叶螨混合在一起发生时，或在幼螨期和若螨期，肉眼根本无法鉴定其种类或者优势种类，在显微镜下，非专业人士也难以鉴定区别三种叶螨，而早期快速鉴定蔬菜上发生的叶螨种类对于监测明确不同叶螨种群的发生特点和规律及后续针对性地施予防治手段具有非常重要的意义。

发明内容

本发明根据上述领域的缺陷和需求，提供一种区分鉴定叶螨的的PCR方法，此方法与传统鉴定方法相比，简便快速，省时省力，田间采集样本后即可进行室内鉴定，且对非分类专业人士来说易于掌握，可为不同叶螨种类提供一种快速的鉴定手段。

鉴定蔬菜叶螨的PCR方法，包括如下步骤：

(1)制备待测叶螨的DNA模板并预混PCR反应成分，

(2)将DNA模板加入到盛有预混PCR反应成分的PCR管中得到PCR反应体系，

(3)PCR扩增，

其特征在于，PCR体系中采用的引物的序列为：5’-ACT TCG CCA C-3’。

所述PCR反应体系为：10μl 2×Es Taq MasterMix，9pg DNA模板，3μl10nMol的引物，补充ddH₂O至20μl。

所述PCR扩增的程序为：94℃，4min；94℃1min，37℃45sec，72℃1min 35s，40个循环；72℃，10min，4℃保存。

上述方法鉴定北方地区的蔬菜上发生的叶螨种类的应用。