[发明专利]猪博卡病毒的LAMP检测试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种猪博卡病毒的LAMP（环介导等温核酸扩增技术）检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

2009年，瑞典科学家利用随机多重置换扩增方法在患有断奶仔猪多系统衰竭综合征的猪淋巴结中扩增出了一段长1879 bp的核苷酸序列，该段序列与已知病毒序列比较，发现其完整的NP1基因及部分VP1/VP2基因与人类博卡病毒相近，故将该病毒归类为细小病毒科、细小病毒亚科、博卡病毒属的猪博卡病毒（Porcine bocavirus, PBoV）（Blomstrom等Detection of a novel porcine boca-like virus in the background of porcine circovirus type 2 induced postweaning multisystemic wasting syndrome. Virus Res. 2009, 146:125-129）。其基因组大小为5.2kb左右，为单股线状DNA。

目前，猪博卡病毒在患病猪中被发现，而在健康猪体内的检出率较低，在患有断奶仔猪多系统衰竭综合征的患病猪中其检出率高达88%（Blomstrom 等 Studies of porcine circovirus type 2, porcine boca-like virus and torque teno virus indicate the presence of multiple viral infections in postweaning multisystemic wasting syndrome pigs. Virus Res. 2010, 152: 59-64）。而且，猪博卡病毒常与猪圆环病毒2型（PCV2）、猪输血传播病毒（TTV）和猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）等发生混合感染，这表明该病毒对断奶仔猪多系统衰竭综合征的发生起着某种作用。2009年，在我国猪群中也发现了猪博卡病毒，其感染率高达38%，表明猪博卡病毒在我国猪群中广泛存在（Zhai等High prevalence of a novel porcine bocavirus in weanling piglets with respiratory tract symptoms in China. Arch Virol. 2010, 155:1313-1317）。

到目前为止，对猪博卡病毒在除瑞典和中国以外的世界其它地方的存在与流行情况一无所知。现如今，对该病毒的检测方法只有普通的PCR方法，其容易产生假阳性，对模板质量、仪器设备要求较高、不适合临床上的现场检测。

环介导的等温核酸扩增技术（LAMP）是由T.Notomi等发明的一种新型核酸扩增技术（Notomi, T., et al., Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acid Res. 2000, 28, e63），该技术依赖4条特异设计的引物和一种具有链置换特性的DNA聚合酶，在等温条件下可以高效、高特异性地扩增靶序列。近年来，国内外已将该技术广泛应用于病原体检测。如LAMP可以检测多种病毒，例如病毒性出血性败血病（VHS）、巨细胞病毒（CMV）、埃博拉病毒（EBOV）、人疱疹病毒、番茄斑萎病毒等。目前国内外均未见LAMP方法在猪博卡病毒检测中的应用。

本发明的猪博卡病毒LAMP检测试剂盒避免了现有检测手段存在的问题，相比较其他的检测手段，建立的猪博卡病毒LAMP方法具有特异性强、敏感度高、检测周期短、操作简单方便的特点。

发明内容

技术问题

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种猪博卡病毒的LAMP检测试剂盒及其检测方法。本发明的试剂盒使用简单，结果鉴定方便直观，检测特异性高，敏感性高，且易于大范围推广应用。

技术方案

本发明是通过以下的技术方案实现的。

本发明设计一种猪博卡病毒的LAMP检测试剂盒，该试剂盒包含如下4条引物，所述引物的碱基序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4所示。