[发明专利]一种高产乳酸的酿酒酵母工程菌的构建及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种高产乳酸工程菌及其构建方法，属于遗传工程领域。本发明还涉及一种产乳酸工程菌的应用，特别是发酵生产乳酸，属于发酵工程领域。

背景技术

作为一种重要的平台化合物，L-乳酸的需求随着石油资源的逐渐枯竭而不断增加。在目前的L-乳酸合成工艺中，以生物质为原料采用微生物发酵(乳酸菌和霉菌)的工艺具有广泛的应用。然而由于乳酸菌营养需求高和难以耐受恶劣环境胁迫，以及霉菌易形成菌丝团和副产物较多等原因，限制了L-乳酸发酵产业的发展，酿酒酵母作为单细胞生物，能利用简单的培养基进行快速生长使其为工业化生产所青睐。通过整合表达乳酸脱氢酶(ldh)于Saccharomy cescerevisiae中可以使L-乳酸得到积累，但副产物乙醇的含量还是很高，为此需要借助基因工程策略，通过游离表达的方式，将源于Streptococcus pneumoniae的NADH氧化酶(nox)表达于整合了ldh的工程菌中，在没有进一步敲除PDC5和增加ldh拷贝数的情况下，通过调节胞内NADH/NAD⁺的水平，实现碳代谢流的重新分配，促进目的产物L-乳酸的积累并大幅度降低副产物乙醇的积累量。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是通过调节胞内NADH/NAD⁺的水平，实现碳代谢流的重新分配，提供一种高产乳酸低产乙醇工程菌。

所述工程菌过量表达源于Streptococcus pneumoniae的NADH氧化酶基因nox。通过调节胞内NADH/NAD⁺的水平，实现了碳代谢流的重新分配，促进L-乳酸的积累并大幅度降低副产物乙醇的积累量。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种上述产乳酸工程菌的构建方法。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案为：

1)分别提取含nox基因的质粒和含ldh基因的质粒。对两质粒双酶切、回收、纯化，连接。

2)将步骤1)连接产物转化到JM109感受态细胞中，涂布带有氨苄抗性的LB平板，挑取转化子。

3)提取质粒酶切验证。

4)将构建好的质粒由LiAc法转化导入受体菌中，涂布Trp缺陷平板。

5)验证所述工程菌。

6)胞内NADH/NAD+的测定。

7)NADH氧化酶的测定。

步骤4)中所述受体菌为整合了ldh基因的酵母工程菌。

本发明要解决的另一个技术问题是提供一种所述高产乳酸低产乙醇工程菌在发酵生产乳酸中的应用。

发酵生产乳酸的工艺为：30℃、200r/min摇瓶培养所述工程菌至对数中期，以8％接种量接种入发酵罐，发酵培养100小时；发酵参数为：pH 5.5，通气量1.5L/min，溶氧50％。

本发明通过游离表达的方法，获得一株高产乳酸低产乙醇的工程菌。本发明提供的工程菌生产乳酸工艺简单易行，发酵100h后，目的产物L-乳酸积累量达到20g/L，而副产物乙醇浓度降为8.2g/L。

附图说明

图1：pY14MET25-nox质粒图谱和nox酶切验证

A：pY14MET25-nox质粒图谱

B：nox酶切验证

Marker：1kb marker 1-2：未酶切质粒对照3-4：酶切后的质粒

图2：nox过量表达对S.cerevisiae生理代谢的影响

A：nox表达前后NADH/NAD⁺的值对比

B：nox表达前后NADH氧化酶活性对比

C：nox表达前后L-乳酸积累量曲线对比

D：nox表达前后乙醇积累量曲线对比

图3：代谢工程策略对碳代谢流分配的影响

B：整合了ldh的工程菌碳流分配

C：nox过量表达后工程菌碳流分配

具体实施方式

以下通过实施例来进一步阐明本发明，下列实施例用于说明发明目的而非用于限制本发明范围。下列实施例中有未注明具体条件的实验方法，基本上是按照常见的分子克隆手册所述的条件进行操作。

实施例1高产乳酸低产乙醇工程菌的构建

1、构建带有ldh-nox基因的质粒

提取质粒pYX212-nox和pY14MET25。用BamHI和SalI酶对两质粒双酶切(图1A)、回收、纯化，连接(16℃过夜)。

2、将步骤1)连接产物转化

将连接产物转化到JM109感受态细胞中后，涂布带有氨苄抗性的LB平板，经37℃过夜培养。

3、提取质粒酶切验证