[发明专利]荧光素标记物及基于荧光偏振的有机磷农药均相多残留免疫检测方法

说明书

技术领域

本发明属于食品安全检测技术领域，涉及一种荧光素标记物及基于荧光偏振的有机磷农药均相多残留免疫检测方法。

背景技术

有机磷农药（organophosphorus pesticides）是一类广谱杀虫剂，在有机氯农药的使用被禁止后，有机磷农药成为我国使用量最大的农药，约占农药杀虫剂总量的70%。由于有机磷农药对人类及动物具有潜在的毒性，其大量的使用已经造成我国蔬菜、食品及环境水等的残留严重超标，不仅对人体产生直接毒害，而且对生态环境造成污染，由饮食品中农药残留量过高而引发的食物中毒事故频繁发生。因此，加强对有机磷农药的监测十分必要。

目前针对有机磷农药的检测主要采用仪器检测的方法和基于胆碱酯酶抑制的酶法。仪器方法如气相色谱（GC）、气-质联用（GC-MS或GC-MS/MS）、高效液相色谱（HPLC）、液-质联用（HPLC-MS或HPLC-MS/MS）等虽然检测灵敏度高，准确度好，但是这些仪器方法价格昂贵，且方法操作复杂，需受过专门训练的人员才能操作，而且存在着适用范围窄、设备昂贵、成本高等问题。基于酶抑制法的产品如酶法速测卡、酶法速测试剂等广泛应用于我国蔬菜水果中有机磷农药的快速检测，不过由于该种方法存在灵敏度较差（0.1～10mg/kg）以及准确度不高（一般低于80%）等不足，已经不能满足目前我国高标准的检测要求。

免疫检测方法以其灵敏、特异、快速、简便的优点在药物残留检测领域已被广泛应用，比起理化检验方法有很多优势。目前，非均相的酶联免疫吸附测定法（ELISA）以其高效、低成本和高灵敏的优势应用的最广，目前已经有许多关于有机磷农药ELISA方法的研究报道，国外也已经有关于有机磷农药商业化的ELISA试剂盒。但是该方法每一步的反应都需要分离反应结合物和未反应的游离试剂，并且需要多步的反应、洗涤，比较非常繁琐。因此，有必要发展一种快速、简便的高通量均相检测方法。

均相的荧光偏振免疫方法，只需一步反应，将待测样品、示踪物和特异性的抗体混合，无需分离洗涤操作，几分钟就可以实现定量检测的目的，非常适合高通量，自动化的免疫检测。虽然目前已有关于有机磷农药的荧光偏振免疫检测方法的零星报道（Kolosova等，J. Agric. Food Chem. 2003, 51, 1107-1114；Tang等，J. Immunoassay Immunochem. 2008, 29,356-369.），但这些方法都是针对单一有机磷农药对象的荧光偏振方法，且灵敏度比较差。目前针对一次可以同时检测多种有机磷农药对象的多残留荧光偏振免疫检测方法，国内外尚未见报道。

发明内容

本发明的目的在于针对现有有机磷农药残留严重、多种对象同时残留以及非均相免疫检测技术中操作复杂、耗时等不足，提供一种荧光标记物，其可应用于基于荧光偏振的有机磷农药均相多残留免疫检测方面。

本发明另一目的在于提供所述荧光标记物的制备方法。

本发明还有一目的在于提供基于荧光偏振的有机磷农药均相多残留免疫检测方法。

本发明上述目的通过以下技术方案予以实现：

提供一种应用于有机磷农药均相多残留免疫检测的荧光素标记物，具有式（Ⅰ）、（Ⅱ）或（Ⅲ）所示结构：

（Ⅰ）

（Ⅱ）

（Ⅲ）

所述荧光标记物的制备方法是采用异硫氰酸荧光素与有机磷农药半抗原偶联得到。具体包括以下步骤：

（1）制备乙二胺衍生化的异硫氰酸荧光素；

（2）活化有机磷农药半抗原：将有机磷农药半抗原、N,N’-二环己基碳二亚胺(DCC)和N-羟基琥珀亚酰胺（NHS）溶于N,N’二甲基甲酰胺（DMF）中，室温搅拌反应过夜，离心去除沉淀得活化的半抗原上清液；

（3）在步骤（2）的离心上清中加入乙二胺衍生化的异硫氰酸荧光素，反应产物用制备型薄层层析板分离纯化即得荧光标记物。

所述有机磷农药半抗原可参见本申请人在申请号为200910036525.X（公开号为CN101475587）说明书中描述的内容。

本发明中所述的有机磷农药多特异性抗体包括有机磷农药的多克隆抗体、单克隆抗体或基因工程抗体，可参见本申请人在申请号为200910036527.9（公开号为CN101463086）说明书中描述的内容。

基于上述荧光标记物，本发明同时提供一种基于荧光偏振的有机磷农药均相多残留免疫检测方法，包括以下步骤：

（1）将待测样品与上述荧光标记物和有机磷农药多特异性抗体混合；