[发明专利]一种新型泥鳅蛋白降压肽及其制备方法

说明书

一、技术领域

本发明涉及一种从泥鳅肉的酶解产物中分离纯化出具有新的氨基酸序列的降压肽及其制备方法与应用，将现代生物技术应用于淡水水产品深加工，属于淡水水产品深加工技术领域。

二、背景技术

食源性蛋白经酶解得到的水解产物大部分是几个氨基酸残基组成的短肽，这些短肽以完整的形式被吸收进入循环系统而被组织利用，具有许多生理活性：抗氧化，提高免疫力，抗菌消炎，促进微量元素的被动转运过程及在体内储存、抗高血压活性等。

血管紧张素转换酶(ACE)是一种含锌的二肽羧酸基肽酶，对调节血压起着关键性的作用，血管紧张素I(AngiotensinI)不具有活性，但是AI在ACE的作用下可以转变为具有活性的血管紧张素II，AII具有收缩血管平滑肌的活性功能，从而引起血压升高。ACE抑制肽是对ACE活性区域亲和力较强的竞争性抑制剂，它们与ACE的活性中心的亲和力比AngI或舒缓激肽对ACE的亲和力更强，并且降血压肽一旦和ACE活性中心结合，就难以释放出来，从而阻碍AngI转化为AngII以及催化水解舒缓激肽成为失活片段，起降血压作用。人工合成的ACE抑制剂具有明显的降压效果，但是副作用太大。食源性蛋白通过不同的酶进行酶解，在其酶解物中发现了许多ACE抑制肽，这些ACE抑制肽安全、新颖、高效。

目前报道的ACE抑制肽主要来源于牛奶、大豆、乳酪、鸡蛋、蛇毒、玉米、食用菌等，水产动物蛋白也陆续报道，如马氏珠母贝、鲨鱼、草鱼等。泥鳅药用价值高，《本草纲目》记载：泥鳅“暖中益气、醒酒、解消渴”。中医认为，泥鳅性味甘平，具有补中益气，祛湿邪之功效，经常食之、可防血管硬化，对高血压、贫血等心血管疾病患者都有辅助治疗作用。目前对泥鳅的研究和应用只限于泥鳅蛋白的抗氧化肽和粘液多糖的抗菌及免疫调节活性方面研究，但是泥鳅蛋白降血压肽研究未见报道。

三、发明内容

发明目的

本发明的目的是为提供一种将泥鳅蛋白酶解及纯化得到的ACE活性较高的、易于消化吸收的新型降压肽。针对现有技术的不足，提供一种泥鳅蛋白降压肽的制备方法与应用。

本发明所述的泥鳅蛋白降压肽Leu-Glu-Tyr，为白色粉末状，易溶于水，具有较高的血管紧张素转换酶(ACE)抑制活性，IC₅₀值为0.103mg/mL。

技术方案

本发明所述的泥鳅蛋白降压肽的制备方法：酶解泥鳅蛋白制备酶解液、酶解液中降血压肽的分离纯化和序列测定，具体步骤如下：

(一)酶解泥鳅蛋白制备酶解液

将泥鳅肉绞成肉糜，加水打浆，然后加入3％0(w/w)菠萝蛋白酶(活力3×10⁵U/g)，调节pH值到5.5-6.0，温度55-60℃，搅拌酶解6小时，灭酶，转速3000rpm离心20min，取上清液，即酶解液。

(二)从酶解液中分离纯化降血压肽

酶解液2％活性碳脱色20min，然后过2500Da的超滤膜超滤，将超滤小于2500Da的超滤液过Sephadex G-15柱，流速1.0mL/min，用蛋白质核酸检测仪，在280nm处进行检测，自动部分收集仪收集洗脱液，冻干秤重后，测定ACE抑制活性，将抑制活性高的组分多次收集，然后进一步用反相高效液相色谱分离；半制备柱ZORBAX SB-C18，流速0.8mL/min，流动相：A：水(含0.1％TFA，v/v)；B：乙腈(含0.1％TFA，v/v)。紫外洗脱液在波长280nm下进行检测，同一峰下的组分收集混合，冷冻干燥，测定ACE抑制活性，得到高活性的ACE抑制肽。

(三)降血压肽的序列测定

将分离纯化得到的具有高活力的ACE抑制肽，用6N的HCl在110℃全水解24小时，用氨基酸自动测定仪测定氨基酸组成。同时，通过质谱仪分析肽的分子量和肽段的分布，然后进行肽的氨基酸序列分析。

所述的(二)中测定肽的ACE抑制活性方法优选的是以N-[3-(2-呋喃)丙烯醇酰]-2-苯丙氨酰甘氨酰甘氨酸(FAPGG)为AngI模拟物的分光光度法，在酶标仪(LB941Tristar，BertholdTechnologies，Bad Wilbad，Germany)上测定。FAPGG在ACE的水解下生成N-[3-(2-呋喃)丙烯醇酰]-2-苯丙氨酸(FAP)和双甘肽(GG)，FAPGG的水解使340nm吸光度降低，降低速率与样品的ACE活性成正比。具体步骤如下：