[发明专利]一类新的纳米金复合底物T-Au的制备和用途

说明书

技术领域

本发明涉及一类纳米金复合底物T-Au的制备及其在分子检测等领域的用途。 

背景技术

纳米金原指直径在1-100nm尺寸的微小金颗粒，一般以分散在水中溶胶形式存在，因此通常称为胶体金。胶体金具有表面积效应，小尺寸效应，微观量子隧道效应等独特的物理化学性质以及良好的生物相容性，非常适合于生物大分子的标记和检测。胶体金用于生物检测已有近一个世纪的历史，上世纪八十年代初免疫金银染色(immuno-gold-siver staining，IGSS)技术的出现是胶体金应用于生物技术的里程碑。该技术首先用胶体金标记待测抗体或抗原，然后在体系中引入银离子。小尺寸效应使胶体金颗粒具有很强的催化还原作用，可以将周围的银离子还原成银颗粒；而银颗粒又可以催化还原周围的银离子。这种级联瀑布催化作用使得银颗粒越聚越多，紧紧包裹胶体金颗粒积聚成团状银壳，形成几乎肉眼可见的黑色颗粒，用普通的电镜甚至肉眼即可观测。IGSS的检测成本远低于荧光检测和化学发光检测，与色原检测相比又显著提高了灵敏度，因此很快得到广泛应用。 

胶体金存在一些固有的缺点：颗粒大小不一、易凝集、与生物分子以静电吸附结合，标记不稳定并且假阳性率高等。为了克服这些缺点，近年来美国Nanoprobes公司开发了一种新型的纳米金颗粒并命名为“Nanogold”，该颗粒是以一个包含大约67个金原子簇化合物为核心的复合体，通过位于其表面的金原子与三芳基磷配基或卤化物离子结合而形成稳定的纳米金分子，其中心粒径仅1.4nm，表面不带电荷，在溶液中程离散状态。这种新型的纳米金与胶体金相比有诸多优点：(1)颗粒小而且均匀一致、标记密度高、穿透性好；(2)经过特定基团修饰后可以与生物大分子以共价键结合，使得标记分子高度稳定；(3)颗粒表面不带电荷，因此不易凝集，适用于很宽的PH值范围和离子强度等等。由于Nanogold有如此多的优点，因此迅速应用于原位杂交、免疫组化、Western等生物检测众多领域。 

生物芯片包括基因芯片、蛋白芯片和组织芯片等，是一项集合了生命科学、微电子学、物理学、化学和材料科学等众多学科的生物高新技术，是高效大规模获取核酸蛋白质等生物信息的重要手段，在基因表达谱研究、疾病分子检测和大规模药物筛选等众多领域具有广阔的应用前景。 荧光检测法是生物芯片的常规检测方法，即荧光色素化合物(Cy3、Cy5等)直接或间接标记在核酸或蛋白质分子上，产生的荧光信号采用激光共聚焦扫描检测。该方法的最大缺点是检测仪器价格昂贵，从而限制了生物芯片的推广和应用，尤其是在中小型医疗机构的推广和应用。为了解决这个问题，近几年已经有研究小组将IGSS技术应用于基因芯片和蛋白芯片的可视化检测，从而避免使用荧光扫描仪，大幅降低了检测成本。其中基因芯片金标银染检测方法已经获得国家专利(一种基因芯片的纳米金标记银染检测方法，ZL专利号：02113147.3)。该方法的缺点是检测灵敏度不高，不能完全满足疾病分子检测领域的要求，进一步提高可视化检测灵敏度是生物芯片推广应用中面临的重要课题。 

为了提高可视化检测灵敏度，本实验室将免疫组化中广泛应用的TSA技术与IGSS相结合应用于生物芯片的检测。TSA(tyramine signal amplification，酪胺信号放大)由Bobrow等人于1989年首次提出的。信号放大分子酪胺是一个酚基化合物，可以作为HRP的作用底物。TSA的原理是在辣根过氧化物酶的催化下，大量连接半抗原的酪胺分子沉积。以基因芯片为例，TSA-IGSS的检测过程如下：首先将点制了探针阵列的基因芯片与待检核酸样本杂交，然后依次加入链酶亲和素标记的HRP、生物素标记的酪胺、链酶亲和素标记的纳米金。最后加入银增强试剂显色。TSA-IGSS比IGSS的检测灵敏度提高10-100倍，目前已经申请专利(一种基因芯片的TSA-纳米金标记银染检测法，专利号：200610135832.x)。该方法的缺点是检测过程相对比较繁琐，能够找导致纳米金直接沉积的新的HRP底物是目前所需要解决的问题。 

发明内容

本发明的目的利用化学方法，提供一类能使HRP直接催化纳米金颗粒沉积，从而显著提高金标记银染色可视化检测灵敏度的纳米金复合底物T-Au。 

本发明的另一目的在于提供所述的纳米金复合底物T-Au的制备方法。 

本发明的另一目的在于提供所述的纳米金复合底物T-Au在生物芯片等分子检测领域的用途。 

本发明的目的是通过如下技术方案实现的。