[发明专利]一组用于检测HBV基因突变的核苷酸序列及其应用

说明书

技术领域

本发明属于病毒基因检测领域，具体涉及一组用于检测HBV基因突变的核苷酸序列及其应用。

背景技术

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)属于嗜肝DNA病毒科(hepadnaviridae)，基因组长约3.2kb，是部分双链环状DNA结构。HBV基因组含有4个部分重叠的开放读框，即前-S/S区、前-C/C区、P区和X区。同一患者体内不同的HBV株基因序列之间可能存在差别，但在遗传学上却高度相关。研究表明，每个患者体内的病毒都是由存在基因序列差异的病毒株组成的病毒群，优势群和劣势群是相对的，并始终处在不断的变化之中。HBV的复制速度很快，据推算，HBV每24小时可复制10¹²～10¹³拷贝。HBV基因组有3200个碱基对，聚合酶错配率为10^-4至10^-5/碱基/循环，因此每天每个碱基都可能发生变化，其突变率约为其他DNA病毒的10倍。研究证实，HBV在逆转录复制过程中所需的RNA聚合酶和逆转录酶缺乏严格的校正功能，使得HBV基因组自身变异率较高。

由于HBV基因的这种高突变率，导致了其对于核苷酸类似物药物容易出现耐药性。常见的抗核苷类药物，主要包括拉米夫定(LAM)、阿德福韦酯(ADV)、恩替卡韦(ETV)和替比夫定(LdT)。经过常年使用这些核苷酸类似物药物，大多数病人体内的HBV病毒已经出现了各种各样的突变，这些突变导致了病人对上述核苷类药物出现耐药性。如果不能及时发现这些突变，就不能及时更换药物种类，从而延误病人的病情，同时也增加了病人的经济负担。因此对于这些病人体内HBV基因突变的情况进行检测是一个临床上急需解决的问题。

目前，国内外对HBV基因突变的检测方法主要有以下几种：

(1)测序法测序法能够检测整个HBV序列中几乎所有可能的突变，一度被视为突变检测的金标准。但测序反应对于少量耐药突变株的检测并不敏感。当耐药株低于50％时，随着耐药毒株比例的下降，基因测序的假阴性率迅猛增高，因此这种方法很容易忽略小于准种20％的低丰度耐药株突变。

(2)限制性片段长度多态性分析(RFLP)首先对每个已知的耐药位点设计野生型和耐药型的特异性核酸内切酶识别位点，经PCR和酶切后，根据酶切图谱来判断是否发生耐药突变。虽然其检测灵敏度较高，但是由于每个检测位点均需要建立一个独立的酶切反应体系，操作繁琐，况且并不是每个耐药位点都可以找到相应的酶切位点，因此技术难度大，临床不宜推广。

(3)线性探针分析法遵循反向杂交的原理，首先根据待测序列设计特异性探针并固化在支持物上，对待测标本特定序列进行PCR扩增，然后将扩增产物与同相探针反向杂交，显色得出结果。目前国外常采用比利时Innogenetics公司生产的INNO-LiPA HBV耐药突变试剂盒，当引起耐药的突变株只占总病毒数很小比例时，LiPA分析就能检测到，因此在疾病进展处于高风险时该方法有优势。但是其价格昂贵，20条检测试纸条进口价格为1万元，国内现仅限于实验研究用。

(4)TaqMan技术PCR技术作为一种快速诊断技术，具有特异性高、灵敏度高、操作简便且价格较便宜等优点。使用常规TaqMan技术进行HBV耐药基因检测设计，对于两种突变的位置相隔很近(中间只隔1个碱基)耐药位点，不利于设计引物，同时，需合成较多简并引物以提高检出率，成本较高，反应体系也很难稳定，并且与其他技术一样无法对病毒的共生关系进行准确判断。

(5)基因芯片该技术是近年兴起的一项技术，在高通量等方面有着其他技术无与伦比的优势，但重复性差、易污染、操作复杂的缺点及其昂贵的价格也使这项技术的推广受到严重制约，特别是对于突变位点不多的HBV耐药基因的检测。

(6)熔点曲线法  该法是利用特异性探针与靶序列结合，分析Tm值改变的原理进行突变。它具有很多TaqMan技术的优势，包括操作简便、成本低廉、灵敏度高等特点，但熔点曲线法有个显著的特点，就是特异性差，也就是说熔点曲线法无法正确区分待检基因突变和临近位点突变，该技术只能应用在附近区域非常保守的突变检测。另外，针对HBV耐药毒株与敏感毒株共存问题，熔点曲线也无法对敏感株和耐药株的比例关系进行准确鉴别，在临床上很难正确指导用药。