[发明专利]纳米脂质体抗牛乳房炎耐药致病菌特异性复合IgY的制备方法及其制剂

权利要求书

1.一种纳米脂质体抗牛乳房炎耐药致病菌特异性复合IgY的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(S1)筛选引致牛乳房炎的代表性耐药致病菌作为病原体，所述耐药致病菌包括无乳链球菌、停乳链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌以及白色念珠菌中的至少两种；

(S2)将所述耐药致病菌混合、粉碎处理后，加入福氏佐剂，再高速匀化处理形成油包水乳液，即制得耐药致病菌蛋白复合抗原；

(S3)采用淘汰法筛选具有高免疫应答能力的选择产蛋禽类，再拣取被选出之产蛋禽类所产的免疫蛋；

(S4)对所述免疫蛋进行消毒，取蛋黄，制得抗牛乳房炎耐药致病菌特异性IgY粗品；

(S5)将所述IgY粗品进一步纯化处理，制得抗牛乳房炎耐药致病菌特异性IgY纯品干粉；

(S6)对所述IgY纯品干粉作纳米化处理，制得纳米化抗牛乳房炎耐药致病菌特异性IgY纯品干粉；

(S7)对所述纳米化抗牛乳房炎耐药致病菌特异性IgY纯品干粉作脂质体化处理，制得纳米脂质体抗牛乳房炎耐药致病菌特异性复合IgY。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

在所述步骤(S1)中包括：在隐性牛乳房炎发生率较多的地区采集无乳链球菌、停乳链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌以及白色念珠菌菌株，分别选择适宜的培养基进行菌株大量繁殖，再收集培养物，提纯、菌株计数，并稀释分装；

在所述步骤(S2)中包括：将所述五种耐药致病菌按重量比1～10∶1～10∶1～10∶1～10∶1～10的比例混合，再采用超声粉碎机进行粉碎处理，获得含全菌和菌体成份的多种耐药致病菌蛋白混合物；将所述耐药致病菌蛋白混合物的浆液以1～10∶1～10的比例加入福氏佐剂，置入高速匀浆器以30,000rpm高速匀化，形成油包水乳液，即制得牛乳房炎耐药致病菌蛋白复合抗原。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步骤(S3)中包括：

选择正在产蛋的健康无特定病原体携带的禽类，然后所述耐药致病菌蛋白复合抗原进行注射免疫，拣取高免疫蛋；

将检取的免疫蛋消毒，取蛋黄，加入4～8倍蒸馏水稀释搅拌均匀，用1mol/l NaOH液、或者1mol/l HCL液调节PH值至5.5～6.0，4～6℃下静置过夜，稀释液8,000～12,000r/min高速离心20分钟，取上清液用超滤机超滤浓缩，得到抗牛乳房炎病原体特异性IgY浓缩液体；

分别以耐药无乳链球菌、停乳链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌以及白色念珠菌作为抗原，采用酶联免疫法检测所制得抗牛乳房炎病原体特异性IgY浓缩液体对无乳链球菌、停乳链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌以及白色念珠菌的抗体结合效价，对于结合效价达到1∶102,400以上的，选出其对应的产蛋禽类。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在所述步骤(S3)中的注射免疫具体包括：在第一次注射后间隔7天，再以同样剂量、方法注射第二次；第二次注射后再间隔7天以相同剂量注射第三次；并自第一次注射后从第20天开始拣取高免疫蛋。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(S6)的纳米化处理步骤包括：取所制得的抗牛乳房炎耐药致病菌特异性IgY纯品干粉，加入超微粉碎机中碾磨粉碎，加工成大小在1～100nm之间、粒度超过≥15000目的超微粒子，即制得相应的纳米化抗牛乳房炎耐药致病菌特异性IgY纯品干粉。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(S7)的脂质体化处理步骤包括：把卵磷脂和胆固醇溶于乙醚中，再将所述纳米化抗牛乳房炎耐药致病菌特异性IgY纯品加入4mmol/L磷酸盐缓冲液配成IgY溶液；然后将含卵磷脂和胆固醇的混悬液与IgY溶液混合，超声处理2min，立即在水浴中减压旋转蒸发至呈凝胶状，漩涡振荡使凝胶转相，再继续蒸发除尽乙醚，进而超速离心分离除去未包入的IgY，沉淀用水洗二次，离心，得沉淀，用10mmol/LPBS稀释，即制得纳米脂质体抗牛乳房炎耐药致病菌特异性复合IgY。

7.一种纳米脂质体抗牛乳房炎耐药致病菌特异性复合IgY制剂，其特征在于，其中包括根据权利要求1所述方法制备的纳米脂质体抗牛乳房炎耐药致病菌特异性复合IgY，还包括针剂或乳膏辅料。

8.根据权利要求7所述的IgY制剂，其特征在于，所述制剂为针剂，所述辅料包括棉籽油、吐温80、以及蒸馏水。

9.根据权利要求7所述的IgY制剂，其特征在于，所述制剂为乳膏，所述辅料包括棉籽油、钛白粉、以及微粉硅胶。