[发明专利]一种新的高效免疫磁珠分选人T淋巴细胞的方法

说明书

技术领域

本发明属于细胞培养领域，具体涉及人T淋巴细胞的分选及免疫磁珠分离法的操作方法。 

背景技术

免疫磁珠分选法是目前科学研究中广泛应用的先进的细胞分离技术。它是通过细胞表面抗原分子与连接磁珠的特异性单克隆抗体结合，在外加磁场的作用下，使得通过单抗与磁珠相连的细胞被吸引而滞留在磁场中；而无此表面抗原的细胞，因不能与连接磁珠的特异性单抗结合，而不能在磁场中停留，借此将细胞分离。作为悬浮生长的细胞，T淋巴细胞不能用贴壁筛选法这种分离贴壁细胞的方法。故分选T淋巴细胞的方法可以则大多数均用免疫磁珠分离方法或者流式细胞术。但是由于流式细胞术对细胞损伤较大，而且可能会对分选出来的细胞造成污染，而无法进行后续实验，所以本实验还是选用免疫磁珠分离方法作为分选T淋巴细胞的首选方法。 

由体内直接取出组织或细胞进行培养叫原代培养。原代培养细胞离体时间短，性状与体内相似，适用于研究。T淋巴细胞的培养则属于原代培养，由于无法传代，导致实验中所用的活细胞数量随实验时间的延长而逐渐下降。故如何能在相同体积的人外周血当中最大化分选出人T淋巴细胞，尽可能延长T淋巴细胞的生存时间，则成为所有在研究淋巴细胞培养领域中关注的一个技术热点。 

本发明的目的是在T淋巴细胞的体外培养技术中，使实验者得到大量纯化的T淋巴细胞。该方法操作简单，可行实用。 

发明内容

为了得到更多数量的纯化的人T淋巴细胞，克服T淋巴细胞无法传代的弱点，本发明提供一种实验操作方法，使得在相同体积的人外周血当中能尽可能多的分选出人T淋巴细胞。 

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：本发明提供一种高效免疫磁珠分选人T淋巴细胞的方法，在实验中，免疫磁珠法在用免疫磁珠分离方法分选T淋巴细胞的过程中，运用密度梯度离心法分离至加入PBS得到以单个核细胞为主的细胞悬液时，不带盖放入磁极5分钟之后，在不拿出磁极的情况下，用移液器吸出细胞悬液，然后再将吸出的细胞悬液又一次吸入试管中，放入磁极5分钟，当第二次则直接倒出细胞悬液，换新PBS，重复两次。加 入RPMI-1640细胞培养液，用台盼兰染色，并且进行活细胞计数，此时细胞数为分离出的T淋巴细胞的数量。首先要动作规范，则在试管与磁极一起将PBS液倒出的时候，动作既要缓慢也要连贯，倒完液体之后则需要停顿几秒。PBS最多换三次，以减少T淋巴细胞的损失。 

本发明的有益效果是故如何能在相同体积的人外周血当中最大化分选出人T淋巴细胞，尽可能延长T淋巴细胞的生存时间，操作简单易行。 

具体实施方式

1.材料与方法 

1.1研究对象 

健康成年人(主要筛选身体健康，无疾病的志愿献血者)T淋巴细胞。 

1.2材料 

正选人CD3试剂盒(StemCell公司)，人淋巴细胞分离液(天津灏洋生物制品科技有限责任公司)，RPMI-1640细胞培养基(成都哈里生物)。 

1.3人外周血单个核细胞的分离培养 

人外周血15ml，肝素抗凝，与D-hank’s缓冲溶液等倍稀释，然后用人淋巴细胞分离液分离(分离液与外周血的比例为1∶1)，以2500转离心20分钟。吸取中间白膜层，加适量D-hank’s缓冲溶液，1500转离心10分钟。用RPMI-1640细胞培养液洗涤一次，弃上清，加入含有2％的胎牛血清和1mmol/L EDTA(乙二胺四乙酸)的PBS(磷酸盐缓冲液)8ml，用台盼兰染色，并且进行活细胞计数，活细胞数均大于90％以上，此时细胞数为分离出的单个核细胞数量。选出数量为1×10⁷个单个核细胞进入下一步实验。 

1.4人外周血T淋巴细胞的分离培养