[发明专利]甲型副伤寒沙门氏菌PagC亚单位疫苗及其制备方法

说明书

技术领域

本文属于生物技术领域，涉及甲型副伤寒沙门氏菌亚单位疫苗及其制备方法。

背景技术

伤寒是一种急性传染病，包括伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhi)引起的伤寒和甲、乙、丙型副伤寒沙门氏菌(Salmonellaparatyphi A，Band C)引起的副伤寒。典型的临床表现包括持续高热、表情淡漠、腹部不适、肝脾肿大和周围血象白细胞低下，部分病人有玫瑰疹和相对缓脉。伤寒还可引起高热和肠道出血，具有很高的传染性。人群对甲型副伤寒沙门氏菌普遍易感，但儿童和青壮年发病率最高。据估计全球每年患伤寒(包括副伤寒)的人数约2200万，死亡率超过0.9％。而近几年来，由于甲型副伤寒沙门氏菌临床耐药株以及多重耐药株广泛存在，致使甲型副伤寒暴发流行。

甲型副伤寒沙门氏菌是无荚膜的革兰氏阴性菌，其外膜蛋白在致病和刺激机体免疫应答方面有不可忽视的作用。研究表明，沙门氏菌外膜蛋白具有良好的免疫原性及免疫保护性。PagC蛋白，其基因组注释为外膜侵袭蛋白，是由pagC基因编码的一个18kDa的外膜蛋白，在沙门氏菌几种伤寒血清型细菌中普遍存在，是沙门氏菌在巨噬细胞中存活及其在小鼠中表现出毒力的主要因素。在霍乱沙门氏菌中此蛋白也能增加动物机体对细菌的免疫反应性。选取PagC作为亚单位疫苗的组分，可以引起有效的免疫应答，抵抗甲型副伤寒沙门氏菌的感染。但国内外对此研究较少，已知的PagC种类较少。到目前为止，还没有将PagC蛋白用于制备甲型副伤寒沙门氏菌疫苗的报道。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种新的甲型副伤寒沙门氏菌外膜蛋白PagC；

本发明的第二个目的在于提供该蛋白在制备甲型副伤寒沙门氏菌亚单位疫苗中的应用。

本发明的第三个目的在于提供一种甲型副伤寒沙门氏菌亚单位疫苗及其制备方法。

本发明甲型副伤寒沙门菌外膜蛋白PagC的氨基酸序列如SEQID No.2所示，实验表明，该蛋白具有良好的免疫保护性，可以用于制备预防或治疗甲型副伤寒的药物，尤其是疫苗。此外，由于PagC具有免疫中和活性，还可以通过制备PagC的特异性抗体来制备抗体药物。

本发明还提供用于编码PagC的基因，其核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示。考虑到密码子的简并性，例如可在其编码区，在不改变氨基酸序列的条件下，或在其非编码区在不影响蛋白表达的条件下，对编码上述蛋白的基因序列进行修改。因此，本发明还包含对编码上述蛋白的基因序列进行的替换、添加和/或缺失一个或多个核苷酸，具有与上述编码基因具有相同功能的核苷酸序列。本发明还包括基于所述基因的正义序列或反义序列，包括含有所述核苷酸序列或其片段的克隆载体或表达载体、含有所述载体的宿主细胞。

本发明还提供制备达甲型副伤寒沙门氏菌外膜蛋白PagC的方法，包括：将编码PagC的基因克隆至表达载体，转化宿主菌，培养转化子，获得重组的目的蛋白。

所述的表达载体选自质粒pET30a及其适用于大肠杆菌系统的所有pET系列表达载体。

所述的大肠杆菌表达菌株选自E.coli BL21(DE3)、E.coliBL21(DE3)pLys、Origami或Rosetta。

述的转化用热休克转化，电转化或原生质体转化。

将所述的PagC基因克隆至质粒pET30a，得到重组表达质粒，然后热休克法转化E.coli BL21(DE3)，经发酵培养、破菌、离心、柱层析纯化得到重组的PagC重组蛋白。

在分发明的一个实施方案中，采用如下方法制备得到外膜蛋白PagC：

(1)在大肠杆菌细胞中进行胞内表达PagC

将PagC基因通过PCR扩增，并引入Nde I和Xho I酶切位点和6×HIS标签，双酶切后重组到大肠杆菌细胞的表达载体pET30a上，形成重组表达载体PagC/pET30a。通过热休克法转化用CaCl₂制备的E.coli DH5α，抽提质粒并双酶切验证正确后，再将重组质粒转化E.coliBL21(DE3)以用于诱导表达PagC蛋白。含有目的基因的大肠杆菌转化子进一步液体发酵并用IPTG诱导表达。收集并破碎大肠杆菌细胞，SDS-PAGE和Western blot鉴定重组蛋白的分子量和免疫原性。(2)重组工程菌PagC/pET30a/BL21的大量发酵及其目的蛋白的纯化

在2L三角瓶中对重组工程菌进行大量诱导表达。确定目的蛋白的表达形式，并计算目标蛋白的表达率和产率；采用超声的方式破菌，经梯度离心的方法制得包涵体；选择GE公司的Ni亲和预装柱进行纯化。4℃下，采用梯度透析复性的方法对已纯化好变性蛋白复性；