[发明专利]用于HIV基因分型的全基因组探针杂交检测方法

说明书

技术领域

本发明属于检测技术领域，具体涉及一种用于HIV基因分型的全基因组探针杂交检测方法。

背景技术

人类免疫缺陷病毒（HIV）具有高度的基因变异性，根据其基因序列的差异，将其分为HIV-1型和HIV-2型。目前世界范围内流行的主要为HIV-1型。HIV-1又进一步分为3个组：M组、0组和N组。M组内又可分为A-D,F-H和J、K9个基因亚型，另外还有34个以上流行重组型（CRF）。到目前为止，我国的感染者中已经确定了A、B’、B、C、D、B/C（CRF07-BC、CRF08-BC）、CRF01-AE和CRF02-AG  8种亚型。 HIV的基因分型最初是依据膜区（env）的基因序列分析确定的，后来gag区也作为HIV分型的依据。 随着更多HIV基因序列的获得，人们发现依据某个片段进行的基因分型往往并不准确，例如最先人们根据HIV env区的gp120和gp41的基因序列确定了E亚型，后来对其gag区和pol区的序列分析发现其属于A亚型，因此，将其重新定义为重组亚型CRF01-AE。随着近些年HIV各种重组类型的不断增多，这种依据部分片段的基因序列进行亚型鉴定的方法越来越受到局限性。依据最新的HIV分类和命名原则，要确定新的亚型必须进行全基因序列分析。

HIV基因亚型的检测的最经典方法是基因测序分析，该方法存在以下明显局限性：（1）技术难度大，要求高：该方法中无论是基因扩增、基因测序还是生物信息学分析，需要非常专业的高端技术人员才能完成，只有在少数高端实验室才能完成。（2）设备昂贵，检测周期长，基因测序仪一般都在200万元以上，一个完整的分析周期至少得两周左右。（3）很难进行全基因序列分析：由于测序费用的昂贵和周期问题，一般都采用测定部分基因片段对HIV进行亚型分析，如前所述，这种来自于部分信息的分析往往会不完全准确。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种用于HIV基因分型的全基因组探针杂交检测方法。该方法可用于简便、快速和更准确地确定HIV的基因亚型。

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：

一种用于HIV基因分型的全基因组探针杂交检测方法，该方法包括以下步骤：

（1）制备待测样品的cDNA；

（2）设计并制备出PCR扩增引物；所述引物为序列表中SEQ ID No: 76- No: 87所示的核苷酸序列；

（3）使用步骤（2）中所述引物采用巢氏PCR方法对步骤（1）中所述cDNA进行PCR扩增；

（4）纯化上述扩增产物；

（5）标记纯化的扩增产物：使用巢式PCR扩增的第二轮反向引物和荧光素Cy5-dCTP进行标记；

（6）将标记产物与基因芯片杂交、洗涤；

其中，所述基因芯片为包括固相载体和固定在该固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针为序列表中SEQ ID No: 1- No: 75所示的核苷酸序列；

（7）用基因芯片扫描仪获取杂交信号并分析鉴定杂交结果，从而确定所检测的基因亚型。

进一步地，在所述步骤（3）中，使用步骤（2）中所述引物采用巢氏PCR方法对步骤（1）中所述cDNA分三段分别进行二轮PCR扩增。

进一步地，在所述步骤（5）中，使用巢式PCR扩增的第二轮反向引物分三段和荧光素Cy5-dCTP进行标记。

进一步地，在所述步骤（6）中，杂交温度为40℃，杂交时间为16h。

进一步地，所述基因芯片的固相载体选自硝酸纤维素膜、尼龙膜、聚苯乙烯或载玻片。

本发明的有益效果：通过对待检样品的扩增和标记，利用本发明的基因芯片可以直接对HIV的基因亚型进行判断。无需复杂的专业分析，具有简单、快捷，成本低等优点，并且，本发明中芯片使用的探针是针对HIV全基因组设计，这样对HIV分型的结果就更加准确和可靠。

附图说明

图1 基因芯片杂交后的扫描结果图（07BC）；

图2 基因芯片杂交后的扫描结果图（B）；

图3 基因芯片杂交后的扫描结果图（01AE）。

具体实施例方式

下面结合具体实施例，进—步阐述本发明。但这些实施例仅限于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

实施例1寡核苷酸探针的制备

1.探针的设计