[发明专利]特异性沉默鸡马立克氏病病毒gI、gE基因的siRNA序列及其载体和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术，涉及分子生物学和基因工程技术领域，具体涉及针对鸡马立克氏病病毒US7(gI)和US8(gE)基因的siRNA序列设计、筛选及其在体外抑制MDV gI和gE的应用。具体地，本发明涉及序列为SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的siRNA序列，其可以特异性干扰鸡马立克氏病病毒gI基因。

背景技术

1.MDV的研究现状

鸡马立克氏病(MD)是鸡的一种淋巴增生性病，在养殖业受到广泛关注。如果缺乏控制手段，MD将产生巨大的损失。MD在1907年被发现，1968年首次分离到鸡马立克氏病病毒(MDV)。MDV属疱疹病毒科双链DNA病毒，基因组接近180kb，MDV具有γ-疱疹病毒的生物学特性，但是根据其基因组结构被归类为α-疱疹病毒。其基因组庞大，由长独特区(UL)及其两侧的反向长重复序列(TRL和IRL)、短独特区(US)及其两侧的反向短重复序列(TRS和IRS)组成。MDV包括三种血清型，凡能引起肿瘤的MDV均属于血清1型(MDV-1)，而天然不致瘤的MDV和火鸡疱疹病毒(HVT)分别属于血清2型和血清3型。相比其他α-疱疹病毒，MDV具有如下特点：严格的细胞结合特性，在淋巴细胞中建立潜伏感染，基因组中包含的致癌基因能够产生淋巴瘤。从1969年开始，MD就通过疫苗免疫得到了很好的控制。然而，伴随着MDV毒力不断增强，疫苗的免疫效果逐步降低，病毒不断演化迫使我们必须加快MD新疫苗的研发进度以应对毒力不断增强所带来的疾病控制压力。然而，新疫苗研发速度还远跟不上病毒进化速度，这对家禽业无疑一个潜在的最 大威胁。另外，，强化商品鸡的生产管理、使鸡早期接触病毒或接种低剂量病毒也是控制该病的一个好方法。现有的结果证明，MD疫苗能有效地控制该病，但是并不能阻止病毒的进化。CVI988病毒株仍然是当前控制MD的最好的疫苗，应对(或者适应)将来不断进化的MDV毒力增强的趋势，开发免疫效果更好的新型MD疫苗是控制该病的一种战略需要。在MD的控制环节上有三个关键控制点，即：呼吸道、细胞间播散、病毒门户(羽毛毛囊上皮细胞)，这三个环节任何一点的突破都会对MD的控制产生跨越性的影响。

2.MDV gI和gE基因及其表达蛋白的研究现状。

gI和gE是MDV基因编码很重要的病毒糖蛋白，位于MDV的基因组的US区，在所有的α-疱疹病毒中均存在编码gE的同源基因，gE中都具有2个保守的半胱氨酸簇，并且gE蛋白C端的半胱氨酸簇在所有的α-疱疹病毒中都有5个半胱氨酸残基，说明疱疹病毒属各成员的gE具有相似的功能很保守。与I型单纯疱疹病毒(HSV-1、VZV、PRV等)有很高的同源性，影响体外病毒的生长。gE是一个重要的毒力基因，gI也与毒力有关，且对诱导完全保护是必须的。gE和gI基因是以非共价键形式结合成复合体gI/gE，它们与MDV在淋巴组中的侵袭和扩散作用密切相关，是影响病毒生长的功能成分。

有文献报道gI/gE是病毒复制、增殖必需基因，gE是gG Fc受体，利用细胞的衔接机制来帮助病毒在细胞间扩散。且gI-gE复合物有助于介导病毒侵入细胞，在细胞间传播起到重要的作用(Schumacher et al.，2001；shamblin et al.，2004；Tischer et al.，2002)。Knapp等的研究证明，缺失gI/gE的PrV对大鼠的毒力大幅度降低，但将BHV-1的gI/gE克隆到该PrV突变株后，重组病毒又恢复了对大鼠的毒力。BHV-1的同源区段能够弥补PrV gE和gI缺失株对小鼠的毒力缺损，这也进一步证明疱疹病毒同源gE蛋白具有相互互补的功能。通过对BHV-1gE缺失突变病毒体外表现型的分析揭示，gE对病毒分泌和蚀斑的缩小都有利。

3.RNA干扰的研究现状