[发明专利]呋喃它酮代谢物检测试剂盒及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物学免疫方法的测定技术领域，特别是涉及一种利用胶体金免疫层析技术制作的一种呋喃它酮代谢物检测试剂盒及其制备方法。

背景技术

硝基呋喃类药物为一种光谱抗生素，主要是指呋喃它酮、呋喃唑酮、呋喃妥因、呋喃西林，具有很好的抗菌作用，被广泛应用于饲料添加剂和治疗药物，用于预防和治疗由沙门氏菌和埃希氏杆菌引起的猪、牛、家禽及蜜蜂的胃肠道疾病。他们对人类健康有恶性影响，有致癌性。

欧盟出于食品安全的考虑，在96/23/EC法规中将硝基呋喃类抗生素列为A类禁用药，决定从1997年1月1日起，禁止在动物饲料中添加任何硝基呋喃类抗生素。我国也于2002年颁布了禁止使用硝基呋喃类抗生素的禁令。欧盟委员会于2003年通过了2003/181/EC委员会决议，建立了用于检测禽肉产品和水产品中硝基呋喃类药物的代谢物的各种方法的最小要求性能限值为1μg/kg。目前，欧盟、美国及其他国家都对进口动物性食品中硝基呋喃类抗生素残留做了非常严格的限制，要求4种硝基呋喃代谢物残留不得超过1μg/kg。

为了人和动物的安全很有必要对水源和食品(如：肉)进行抗生素残留检测。呋喃类药物本身的检测很难，因为在食入这些药物后会很快地发生代谢。这些代谢产物会在组织中存在很长时间。AMOZ是呋喃它酮的代谢物，在一般的烹调中不易分解，在温和的酸性条件下可以从组织中释放出来。因此可以用来做检测使用。

目前，检测呋喃它酮代谢物AMOZ的方法主要有高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱-质谱法(LC-MS)、液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)、酶联免疫分析法(ELISA)。这些方法灵敏度高，结果准确，但是具有需要昂贵的仪器，检测繁琐、费时，检测人员需要一定的专业培训等缺点。

本发明采用胶体金免疫层析技术制备了一种呋喃它酮代谢物检测试剂盒。本发明具有操作简单、检测快速、灵敏度高、无需复杂仪器等特点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种简单、快捷、灵敏度高、成本低的呋喃它酮代谢物检测试剂盒及其制备方法。

一种呋喃它酮代谢物检测试剂盒，包括样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜、吸样垫和PVC支撑板，在PVC支撑板上依次紧密粘附有样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸样垫。所述样品垫为玻璃纤维；所述胶体金垫为胶体金标记的AMOZ衍生物多克隆抗体聚酯膜；所述硝酸纤维素膜上依次包被有检测线(T线)和质控线(C线)，其中检测线(T线)上包被了AMOZ衍生物偶联载体蛋白，质控线(C线)上包被了羊抗兔IgG抗体；所述吸样垫为吸水纸。

偶联呋喃它酮代谢物的载体蛋白为牛血清白蛋白(BSA)或卵清白蛋白(OVA)。

本发明采用纳米胶体金技术及抗原抗体特异性反应，应用免疫竞争抑制反应的原理制备而成，通过待检样本中可能含有的AMOZ衍生物与硝酸纤维素膜上检测线(T线)包被的AMOZ衍生物偶联载体蛋白竞争结合胶体金标记的AMOZ衍生物抗体的反应，使T线显现肉眼可见红色条带用于判定待检样本中是否含有AMOZ。

本发明提供了一种呋喃它酮代谢物检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

(1)制备AMOZ衍生物偶联载体蛋白

呋喃它酮是小分子物质，只有免疫反应性，没有免疫原性，不能诱发机体产生免疫应答，必须与大分子载体蛋白偶联后才能具有免疫原性。将AMOZ和间羧基苯丙醛在水中反应进行衍生化得到AMOZ衍生物半抗原。采用NHS活性酯法将AMOZ衍生物半抗原与载体蛋白偶联得到AMOZ衍生物偶联载体蛋白作为免疫原和包被原。其中载体蛋白为牛血清白蛋白(BSA)或卵清白蛋白(OVA)。

(2)制备AMOZ衍生物多克隆抗体

采用AMOZ衍生物偶联载体蛋白作为免疫原免疫白兔，制备抗AMOZ衍生物多克隆抗体。

(3)制备胶体金

取0.01％的氯金酸水溶液，加热煮沸。根据需要迅速加入1％枸橼酸三钠水溶液1ml，继续煮沸约5min，出现橙红色。这样制成的胶体金颗粒的大小为20-40nm。

(4)制备胶体金垫