[发明专利]融合蛋白TETPH、表达载体及其构建方法

权利要求书

1.融合蛋白，其具有如SEQ ID NO1所示氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其C端还带有his标签。

3.根据权利要求2所述的融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO3所示，从N端至C端依次为Trx标签、EK识别序列、sTrail肽段、uPA识别序列、His标签，命名为TETPH。

4.编码权利要求1-3任一所述融合蛋白的基因。

5.根据权利要求4所述的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO2或SEQ ID NO4所示。

6.一种表达载体，为pET-32a/sTrail-uPAc-his，其结构如图9所示。

7.权利要求6所述的表达载体的构建方法，包括如下步骤：

(1)采用RT-PCR法，以人胎盘组织总RNA为模板，以上游SEQ ID NO7和下游SEQ ID NO8为引物对，扩增得到PCR产物I，克隆入载体pMD18-T，得到阳性质粒pMD18-T/sTrail，

上游SEQ ID NO7：5’-GCGGATCCGTGAGAGAAAGAGGTCCTCAG-3’，

下游SEQ ID NO8：5’-ATCTGCAGTTAGC CAACTAAAAAGGCCC-3’，

(2)采用引物延伸法，以pMD18-T/sTrail为模板，以上游SEQ ID NO9和下游SEQ ID NO10为引物对，扩增得到PCR产物II，再用限制性内切酶切割PCR产物II和pET-32a载体，回收含sTrail-uPAc-his cDNA片段和pET-32a骨架片段，纯化后连接，得到阳性质粒pET-32a/sTrail-uPAc-his，上游SEQ ID NO9：5′-CATGCCATGGCTGTGAGAGAAAGAGGTCCTCAGAGAGTAGC-3′，下游SEQID NO10：5′-CCGCTCGAGTTATCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTGCTGATCGTCCGCTGCCAACTAAAAAGGCCCCGAAAAAAC-3′。

8.生产权利要求1-3任一融合蛋白的方法，包括如下步骤：

(1)将pET-32a/sTrail-uPAc-his转化表达菌BL21，

(2)挑取克隆转种于含50μg/ml Amp的LB培养基中，37℃，220r/min振摇培养至对数生长期，加入0.4mmol/L IPTG，于28℃过夜诱导，使转化的细菌表达融合蛋白TETPH。

9.根据权利要求8所述的方法，还包括表达产物的分离、纯化和纯化后的酶切步骤，所述分离步骤为4℃，6000r/min离心15min收集细菌，10倍体积的pH7.3的PBS重悬菌体，超声破碎，破菌时加入PMSF和DTT，防蛋白降解，破菌完全后于4℃，10000r/min离心15min，留取上清及沉淀，上清以0.45μm微孔滤膜过滤，Western blot检测融合蛋白在上清和沉淀中的含量；所述纯化步骤为采用金属螯合Ni2+柱，上清上样，以Elution Buffer洗脱，所述Elution Buffer组成为20mM磷酸钠，0.5MNaCl，8M尿素，0.5M咪唑，pH7.4；所述纯化后的酶切为向融合蛋白溶液中加入EK酶，过夜即可得到目的蛋白sTrail-uPAc。

10.权利要求1-3任一所述融合蛋白在制备治疗肺癌的药物中的应用。