[发明专利]紫贻贝Hydramacin-1基因及其重组蛋白和制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及克隆基因和抗菌肽，具体涉及紫贻贝Hydramacin-1基因及其重组蛋白和制备方法。

背景技术

抗菌肽是一类广泛存在于整个生物界中的双亲性小分子碱性多肽，是机体先天免疫的关键因子。根据抗菌肽的序列、二级结构和抗菌特性等，将已发现的抗菌肽分为三大类：(1)不含半胱氨酸的线型抗菌肽，如天蚕素、马盖宁等；(2)具有半胱氨酸的环型抗菌肽，如防御素，抗真菌肽等；(3)富含某一种或两种氨基酸的抗菌肽，主要包括富含脯氨酸的抗菌肽以及富含甘氨酸的抗菌肽等。此外，近年来发现某些抗菌肽可由前体大分子酶解产生，如淡水螯虾(Pacifastacus leniusculus)的血蓝蛋白C-端酶解后可产生具有抗菌活性的多肽。抗菌肽的作用机理与传统抗生素不同，它的靶位点主要是病原体细胞膜，因此不易产生抗性，并且抗菌肽对真核细胞几乎没有毒副作用，仅仅作用于原核细胞和发生病变的真核细胞。抗菌肽不仅作用于革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌，而且也作用于真菌、原虫、某些病毒和肿瘤细胞，同时，还能加速免疫和伤口愈合过程。由于病原菌对抗生素逐步产生抗药性，抗菌肽为开发新的抗细菌、抗真菌、抗病毒和抗肿瘤药物开辟了广阔的前景。软体动物抗菌肽的研究始于1996年，Charlet等从贻贝(Mytilusedulis)中分离到了富含半胱氨酸的贻贝素(mytilin，具有8个保守的半胱氨酸残基)和贻贝霉素(mytimicin，具有12个半胱氨酸)，序列比对表明与昆虫抗菌肽有较高的相似性。Hubert从贻贝(Mytilus galloprovincialis)中纯化到含4对二硫键的MGD1(含有38个氨基酸残基，含有2个半胱氨酸)，其具有广谱的抗G⁺和G^-活性。

发明内容

本发明从紫贻贝中克隆得到如序列表SEQ ID NO.1所示的Hydramacin-1基因，该克隆基因的表达得到如序列表SEQ ID NO.2所示的重组蛋白，该重组蛋白为新的紫贻贝抗菌肽，对革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌等具有抗菌效果。

本发明还提供了紫贻贝Hydramacin-1基因和重组蛋白的制备方法，该制备方法能得到纯度较高的紫贻贝抗菌肽，紫贻贝抗菌肽具有开发抗菌药物应用的前景。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种紫贻贝Hydramacin-1基因，为克隆基因，该Hydramacin-1基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示；该克隆基因表达的重组蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示，该重组蛋白即为紫贻贝抗菌肽，对革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌等具有抗菌效果。

紫贻贝抗菌肽的制备方法，包括下述步骤：

1)总RNA提取：用Trizol试剂从感染鳗弧菌的紫贻贝的血淋巴中提取总RNA，得到RNA，存于-80℃备用；提取方法依Invitrogen公司的Trizol试剂说明书进行；

2)mRNA纯化：用Oligotex mRNA纯化试剂盒将上述总RNA纯化得到mRNA；纯化方法依据QIAGENE公司的Oligotex mRNA纯化试剂盒说明书进行；

3)cDNA模板溶液制备：用cDNA Synthesis Kit试剂盒(购于Stratagene公司)将上述mRNA逆转录并酶切为酶切片段，具体操作方法依试剂盒说明书进行：包括双链cDNA经末端补平、EcoR I接头连接、EcoR I末端磷酸化、Xho I内切酶酶切等，用QIAEX IIAgarose Gel Extraction Kit纯化试剂盒(购于QIAGEN公司)对大于100bp的酶切片段进行回收，回收的酶切片段与Uni-ZAP XRvector载体(购于Invetrogen公司)连接，得到是cDNA质粒，用ZAP-III Gold Cloning Kit试剂盒(购于Stratagene公司)对cDNA质粒进行噬菌体包装、滴度测定、噬菌体文库扩增，扩增后的噬菌体文库加入体积百分终浓度为7％的二甲基亚砜(DMSO)，得到含抗菌肽基因的cDNA模板溶液，存于-80℃；具体包装、测定和扩增方法依试剂盒说明书进行；

4)抗菌肽基因筛选：