[发明专利]以花生半片成熟种子为受体的非组织培养基因转化方法

权利要求书

1.一种以花生半片成熟种子为受体的非组织培养基因转化方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)将花生种子去壳，用蒸馏水冲洗，再在蒸馏水中浸泡30-60分钟；然后消毒，去种皮，沿子叶间缝隙切开种子，取含胚的半粒种子，再沿胚的子叶节点切去胚芽，得到待转化的外植体；

(2)将含有待转化质粒的农杆菌接种至YEP液体培养液中，28℃振荡培养过夜；将YEP液体培养液离心收集农杆菌菌体，并将农杆菌菌体重悬于含有乙酰丁香酮的液体MS培养基中，得到侵染液；

(3)将待转化的外植体浸浮于侵染液中10-20分钟，然后将外植体和侵染液在真空条件下静置10-20分钟；取出外植体，滤干菌液后平铺于共培养培养基中，黑暗培养2-3天；再在光照16h/d的条件下培养7-10天，得到共培养后的外植体；

(4)将共培养后的外植体移至灭菌砂土中，培养驯化后，移入温室中繁殖。

2.根据权利要求1所述一种以花生半片成熟种子为受体的非组织培养基因转化方法，其特征在于：步骤(1)所述消毒是指将去壳后的花生种子在无菌环境下置于体积分数为75％的乙醇中浸泡消毒20-30秒，然后用无菌水冲洗1-2次，再置于质量体积分数为0.1％的HgCl₂溶液中浸泡消毒8-10min，然后用无菌水冲洗4-5次，滤干。

3.根据权利要求1所述一种以花生半片成熟种子为受体的非组织培养基因转化方法，其特征在于：步骤(2)所述农杆菌为菌株EHA105。

4.根据权利要求1所述一种以花生半片成熟种子为受体的非组织培养基因转化方法，其特征在于：步骤(2)所述待转化质粒为植物表达载体pCAMBIA3301或pCAMBIA1301-GmFAD3C。

5.根据权利要求1所述一种以花生半片成熟种子为受体的非组织培养基因转化方法，其特征在于：步骤(2)所述液体MS培养基含有100mmol/L的乙酰丁香酮。

6.根据权利要求1所述一种以花生半片成熟种子为受体的非组织培养基因转化方法，其特征在于：步骤(2)所述侵染液的浓度为OD₆₀₀＝0.6～1.0。

7.根据权利要求1所述一种以花生半片成熟种子为受体的非组织培养基因转化方法，其特征在于：步骤(3)所述真空条件是指真空度为25-40Kpa。

8.根据权利要求1所述一种以花生半片成熟种子为受体的非组织培养基因转化方法，其特征在于：步骤(3)所述共培养培养基是含有100uM乙酰丁香酮的MS培养基。

9.根据权利要求1所述一种以花生半片成熟种子为受体的非组织培养基因转化方法，其特征在于：步骤(3)所述黑暗培养，其环境温度为24～28℃。

10.根据权利要求1所述一种以花生半片成熟种子为受体的非组织培养基因转化方法，其特征在于：步骤(4)所述灭菌砂土的湿度为70～85％；所述温室，其温度为24-30℃、湿度为40-60％。