[发明专利]一种纤维素酶的制备方法

权利要求书

1.一种纤维素酶的制备方法，它包括以下步骤：

步骤一，斜面孢子制备：选择绿色木霉作为发酵菌种，将保存的绿色木霉接种于斜面培养基中，静置培养，每日观察，一段时间后，在绿色木霉培养后的菌丝表面形成一层灰绿色孢子，灰绿色孢子既可用为斜面孢子；

步骤二，液体种子制备：将斜面孢子接种于种子培养基中，达到108个孢子/ml然后进一步培养使孢子萌发，孢子萌发后即可作为种子；

步骤三，将种子与发酵料质量比1∶10的比例，均匀的倒在发酵培养基上进行固态浅盘培养，拌匀、摊平，放入发酵培养室进行培养，从进入培养室开始，每隔一段时间需要向浅盘内进行浇水，根据浅盘中物料湿度大小可以减少或增加浇水量；

步骤四，当培养到第七天、第八天和第九天时，分别这三天的浅盘内的物料进行采样，测定这三天中浅盘中物料的水分和酶活性，当纤维素酶活性大于110U/g干曲时即可结束发酵，发酵结束湿曲，无异味，蛋白含量高，可直接用于牛羊饲喂，酶活力高，牛羊消化率高，效果好。

2.根据权利要求1所述的纤维素酶的制备方法，其特征是步骤一中所述的斜面培养基容量为1L的制备方法：称取去皮新鲜土豆200克，切成小块，加水至1L，煮沸30分钟，用纱布过滤后加20克葡萄糖、15克琼脂粉，在电炉上加热至琼脂溶化，加水补足1L，分装至已空消过的试管中，置灭菌锅中121℃灭菌20分钟，倾斜静置，待凝固后备用。

3.根据权利要求1所述的纤维素酶的制备方法，其特征是步骤一中所述的绿色木霉接种于斜面培养基中在35℃的条件下静置培养5天，每日观察，在5天后，在绿色木霉培养后的菌丝表面形成一层灰绿色孢子。

4.根据权利要求1所述的纤维素酶的制备方法，其特征是步骤二中的所述的种子培养基容量为1L的制备方法：葡萄糖20g，蛋白胨10g，酵母膏10g，硫酸铵5.0g，磷酸二氢钾6g氯化钙1g，七水硫酸镁1g，碳酸钙0.5g，PH值为5.6，分装，置灭菌锅中121℃灭菌20分钟。

5.根据权利要求1所述的纤维素酶的制备方法，其特征是步骤二中斜面孢子接种于种子培养基中时在温度为30℃，转速为50r/min萌发培养6h，萌发后的孢子数含量为108个/ml。

6.根据权利要求1所述的纤维素酶的制备方法，其特征是步骤三中所述的发酵培养基质量为1kg的制备方法：称取硫酸铵20g，尿素5g，磷酸二氢钾5g，碳酸钙5g，七水硫酸镁2.5g，氯化钴0.5g，七水硫酸镁1g溶于2L水，pH自然。再称取：稻草800g，麸皮200g，将2L盐溶液倒入稻草粉和麸皮混合物中，充分拌匀，装盘，装盘厚度为8-10cm，121℃灭菌60min或常压蒸锅灭菌16h。

7.根据权利要求1所述的纤维素酶的制备方法，其特征是步骤三中倒在发酵培养基上进行培养的种子为步骤二中种子总量的10％，放入发酵培养室后的温度控制在28～30℃，在浅盘中物料的温度高于室温2℃左右，湿度控制在80％，培养周期为7-9天，培养期间可以通过空调和加湿装置来调节室内的温度和湿度，当出现发酵培养室内上下温度不均衡时，可采用改变浅盘的摆放位置来调节物料温度、湿度和供氧情况，从进入培养室开始，每隔12h时间需要向浅盘内进行浇水，所浇的水为无菌水。

8.根据权利要求1所述的纤维素酶的制备方法，其特征是步骤四中结束发酵后将物料在50℃热空气下烘干，即制得纤维素粗酶，纤维素粗酶直接应用于饲料添加剂。

9.根据权利要求1所述的纤维素酶的制备方法，其特征是步骤四中结束发酵后将物料在浸提灌中以5倍水在30℃下，缓慢搅拌2h，过滤得到上清夜可作为粗酶液，将粗酶液浓缩，喷雾干燥可得粉状工业酶。