[发明专利]一种分离产生纤维素酶细菌的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及一种高效的产生纤维素酶细菌的分离方法。

背景技术

纤维素生物质是一种丰富的可再生资源，有巨大的潜在价值，可利用生物转化技术生产可增值生物产品。近几年来，有效利用生物质的发展日益更加得到了重视。然而，生物质的生物精炼过程在经济上仍不太可行，这是由于缺乏一种廉价高效的生物催化剂。

纤维素酶产生细菌是纤维素酶的一个新来源。纤维素酶(Cellulase)是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称，是一类具有催化纤维素分解成葡萄糖的生物活性蛋白质，纤维素酶的研究最早是1906年Seilliere在蜗牛的消化液中发现了能分解纤维素的纤维素酶。它可将丰富的纤维素废弃资源转化为再生资源，解决能源、饲料和食品供应之不足。

传统的产生纤维素酶的细菌的分离方法，是先分离大量的细菌，再分析其酶活性，筛选具纤维素酶活的微生物菌株。通常筛选具纤维素酶活的微生物菌株在含羧甲基纤维素(CMC)平板上进行筛选。这种方法准确度不好，并且水解带也不易辨别，分离过程时间较长，研究者不能快速、直观了解菌株的酶活情况。

Thomas为了确定Phytophthora菌丝的组成和结构，针对九个不同种类的Phytophthora进行了研究。发现其基本结构是两种形式纤维素混合物与几丁质的叠加，有己糖，不存在果胶化合物。当用偏振光观察时，不同种类的Phytophthora新老菌丝有相同的表象特征。Phytophthora是一种土传卵菌病原体，能够感染多种植物，包括一些茄科植物。Phytophthora(P.)soyae Kaufman& Gerdemann是大豆疫霉病的病原菌，和Phytophthora的特征一样，是由己糖组成。还有研究发现，富含纤维素的疫霉能被产纤维素酶的腐霉所破坏。

高效纤维素酶产生菌平板筛选技术必须是能够提供一个更加快速，更易辨别的方法。纤维素酶是利用丰富的可再生资源纤维素的关键，纤维素酶产生菌是产纤维素酶的重要来源。传统的筛选纤维素酶产生菌的方法效率低，且肉眼不可见。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速、简便、高效率分离产纤维素酶菌的方法，本发明所述方法有利于纤维素酶的开发利用。

实现的技术方案是：

采用本发明方法分离产纤维素酶菌，有以下步骤：

1)取土壤样品，加无菌水研磨，静置10分钟，得到土壤悬浮液，取所述土壤悬浮液涂于LB培养基(Luria-Bertani medium)平板上；

2)28℃恒温箱中培养，48h挑取单菌落纯化，得到纯菌株；

3)先在芝麻培养基上培养大豆疫霉，再在筛选培养基平板中心接种大豆疫霉，两侧对称接种待测细菌菌株，在28℃下培养3天，观察，有抑制带的即为产纤维素酶的菌株。

步骤3)中筛选培养基上平板中心接种大豆疫霉的菌块d＝0.4cm。

步骤3)中筛选培养基上平板中心接种大豆疫霉的两侧对称接种待测细菌菌株，距中心2.5cm，每个菌株重复3次。

本发明利用了细菌和真菌的拮抗机制，Phytophthora(P.)soyae Kaufman& Gerdemann菌丝中的纤维素能被纤维素酶产生菌产的纤维素酶降解。筛选纤维素酶产生菌是基于P.soyae Kaufman & Gerdemann上的纤维素被作为是细菌纤维素酶的目标底物，其实验结果是直接明显的。P.soyae Kaufman &Gerdemann结构特征被利用了，P.soyae Kaufman & Gerdemann和纤维素酶产生菌在平板上对峙培养，如果细菌可以产生纤维酶素，则P.soyae Kaufman &Gerdemann生长被抑制。这种现象很容易观察，筛选效率可以很大程度上提高。

本研究的筛选方法为基于纤维素酶产生菌和P.soyae Kaufman &Gerdemann在平板培养基相互作用的特征的一种新方法，结果表明，抑制区的大小和细菌菌株纤维素酶活力基本上一致。

本发明方法所述纤维素酶产生菌在琼脂培养基上抑制了真菌的生长，目标菌肉眼很容易看见，不需要先进的仪器检测分析。在高通量的试验室筛选中，这种方法快速，简便，高效的鉴定纤维素酶产生菌，利于纤维素酶的利用。

附图说明

图1为Puc-83的抑菌带，其中A为对照，B为Puc-83的抑菌带，其中中间为P.soyae Kaufman & Gerdemann，两边为Puc-83；