[发明专利]用于实时PCR的核酸模板制备

权利要求书

1.一种制备用于实时PCR扩增的核酸模板的方法，所述方法包括以下步骤：

在裂解试剂中裂解细胞，所述裂解试剂包括pH为大约6至大约9的缓冲液、浓度为大约0.125％至大约2％的两性离子洗涤剂、浓度为大约0.3mg/ml至大约2.5mg/ml的叠氮化物以及蛋白酶，

使所产生的细胞裂解物在大约55℃孵育大约15分钟，以产生基本上无蛋白质的细胞裂解物，

使所述蛋白酶在大约95℃失活大约10分钟，

将所述无蛋白质的细胞裂解物直接加入到实时PCR扩增反应混合物中，所述实时PCR扩增反应混合物包括：一对扩增引物，能够退火以在所述细胞裂解物中获得目标DNA；包括能够检测的标记的探针以及与所述目标DNA的区域基本上互补的DNA和RNA核酸序列；扩增聚合酶活性；扩增缓冲液；RNase H活性，

其中，在所述目标DNA在第一扩增引物和第二扩增引物之间扩增之后，所述探针内的RNA序列能够与所述目标DNA中的互补的DNA序列形成RNA:DNA异源双链体。

2.根据权利要求1所述的制备用于实时PCR扩增的核酸模板的方法，其中，所述细胞裂解物的加入允许对所述细胞裂解物中的单个目标DNA分子进行实时PCR检测。

3.根据权利要求1所述的制备用于实时PCR扩增的核酸模板的方法，其中，单个目标DNA分子的实时PCR检测需要少于大约50个的PCR扩增循环。

4.根据权利要求1所述的制备用于实时PCR扩增的核酸模板的方法，其中，所述扩增反应混合物还包括逆转录活性。

5.根据权利要求1所述的制备用于实时PCR扩增的核酸模板的方法，其中，所述探针用荧光共振能量转移对来标记。

6.根据权利要求1所述的制备用于实时PCR扩增的核酸模板的方法，其中，所述无蛋白质的细胞裂解物由所述扩增反应混合物稀释5-15倍。

7.根据权利要求1所述的制备用于实时PCR扩增的核酸模板的方法，其中，所述细胞是革兰氏阳性细菌细胞和革兰氏阴性细菌细胞。

8.根据权利要求7所述的制备用于实时PCR扩增的核酸模板的方法，其中，所述革兰氏阳性细菌细胞是Listeria。

9.根据权利要求1所述的制备用于实时PCR扩增的核酸模板的方法，其中，所述缓冲液包括醋酸盐或磷酸盐缓冲液、Tris、3-(N-吗啉代)丙烷磺酸、N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(2-乙烷磺酸)或者2-氨基-2-羟甲基-1，3-丙二醇缓冲液。

10.根据权利要求1所述的制备用于实时PCR扩增的核酸模板的方法，其中，所述两性离子洗涤剂是3-[(3-胆汁氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸盐。

11.根据权利要求1所述的制备用于实时PCR扩增的核酸模板的方法，其中，所述蛋白酶是蛋白酶K。

12.根据权利要求1所述的制备用于实时PCR扩增的核酸模板的方法，其中，扩增活性包括热稳定的扩增活性。

13.根据权利要求1所述的制备用于实时PCR扩增的核酸模板的方法，其中，所述RNase H活性包括热稳定的RNase H活性。

14.根据权利要求1所述的制备用于实时PCR扩增的核酸模板的方法，其中，所述RNase H活性是热启动RNase H活性。

15.一种制备用于实时PCR扩增的核酸模板的方法，所述方法包括以下步骤：

在裂解试剂中裂解细胞，所述裂解试剂包括pH为大约6至大约9的缓冲液、浓度为大约0.125％至大约2％的两性离子洗涤剂和浓度为大约0.3mg/ml至大约2.5mg/ml的叠氮化物，

使细胞裂解物在大约55℃孵育大约15分钟，

将所述细胞裂解物直接加入到扩增反应混合物中，所述扩增反应混合物包括：一对扩增引物，能够退火以在所述细胞裂解物中获得目标DNA；包括能够检测的标记的探针以及与所述目标DNA的区域基本上互补的DNA和RNA核酸序列；扩增聚合酶活性；扩增缓冲液；RNase H活性，

其中，在所述目标DNA在第一扩增引物和第二扩增引物之间扩增之后，所述探针内的RNA序列能够与所述目标DNA中的互补的DNA序列形成RNA:DNA异源双链体。