[发明专利]以大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位为载体的表位递送系统

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及以大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位为载体的抗原表位递送系统的设计与制备方法，涉及该系统在B细胞表位疫苗及T细胞表位疫苗中的应用。

背景技术

表位(epitope)是抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团，又称抗原决定簇(antigenic determinant)，它是T细胞抗原受体(Tcell receptor，TCR)和B细胞抗原受体(B cell receptor，BCR)及抗体特异结合的基本单位。在免疫应答中，TCR和BCR所识别的抗原表位不同，分别称为T细胞表位和B细胞表位。主要组织相容性复合体(major histocompatibilitycomplex，MHC)是高度多态性的细胞表面分子，它将多肽片段递呈给T细胞。与MHC I类分子结合的抗原肽为8～12个氨基酸，是来自内源性抗原经蛋白酶降解后的产物。蛋白酶水解片段通过抗原加工相关转运体(transporter associated with antigen processing，TAP)转运至内质网与新合成的MHC I类分子相结合，MHC肽复合体转移至细胞表面被CD8+细胞毒性T细胞的TCR识别。MHCII类分子结合肽长度变化较大，为9～25个氨基酸，主要由外源蛋白通过溶酶体中的蛋白酶降解而来。在内体-溶酶体中与MHC II类分子结合后，MHC肽复合体也转运至细胞表面，被CD4+T细胞TCR识别。据此可设计出两大类T细胞疫苗，即与相应的MHC I及MHCII类分子相关的CD8+T细胞疫苗和CD4+T细胞疫苗。

CD4+辅助性T细胞(helperTcell，Th)又分为分泌不同细胞因子却又交叉调节的两群，即Th1和Th2。Th1亚群主要分泌白介素-2(IL-2)、γ干扰素(IFN-γ)和肿瘤坏死因素-β(TNF-β)，Th2亚群主要分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-13。据此人们可设计出诱导Th1或Th2应答的疫苗抗原分子。根据机体对病原体或肿瘤的免疫应答特点，可以选择特异性Th或细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位以定向诱导宿主的Th应答或CTL应答，甚至通过选择Th1表位或Th2表位，可诱导机体向Th1或Th2型免疫应答定向发展。作为理想的免疫原，抗原分子中可同时包含目的抗原B细胞表位和自身或外源T细胞表位，可诱导出度高特异性的体液或细胞免疫反应，从体液免疫和细胞免疫水平起到预防或治疗作用，因此可赋予较广的保护性。通过设计隐藏于抗原分子内部的表位可增强抗原的免疫原性，泛DR辅助T细胞表位(pan-DRhelperTcell epitopes，PADRE)或通用T表位(universalTepitope)以高亲和力与人群常见人类白细胞抗原-DR(HLA-DR)分子结合，较少受MHC限制。

虽然表位疫苗具有许多优点，并且其研究也取得了重大的进展，但由于缺乏天然蛋白的三维结构，表位疫苗的分子小，免疫原性差，半衰期短，使机体无法产生免疫反应，还可能引起免疫耐受。因此提高与抗体的亲和力、增加免疫原性与稳定性是近年来表位疫苗的研究热点。目前用于解决这一问题的途径主要有：氨基酸修饰、多表位串连展示到某个载体上。选择包含无关Th表位的蛋白分子作为载体，可以避免慢性感染者普遍存在的HLA-II类限制性耐受，诱导Th1类细胞因子占据优势地位。BSA，GST，匙孔血蓝蛋白(keyhole lmi pethemocyanin，KLH)和破伤风类毒素(tetanus toxoid，TT)均可成为载体蛋白。通过化学偶联或融合表达的方法将表位与蛋白载体连在一起，免疫小鼠可诱导特异针对肽的免疫反应出现。此外，表位肽的有效性不仅取决于自身，还与不同的载体蛋白相关，良好的载体有利于加强表位的免疫源。