[发明专利]一种二氨基丁酸-2-酮戊二酸转氨酶及其应用

权利要求书

1.一种二氨基丁酸-2-酮戊二酸转氨酶，其特征在于它具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

2.一种权利要求1所示二氨基丁酸-2-酮戊二酸转氨酶的编码基因，其特征在于它具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

3.一种表达载体，其特征在于包含权利要求2所述的二氨基丁酸-2-酮戊二酸转氨酶基因。

4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于所述的表达载体为pET-28a(+)。

5.一种基因工程菌，其特征在于它包含权利要求3所述的表达载体。

6.根据权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于所述的基因工程菌为包含有重组质粒pET-dabat的E.coli BL21(DE3)。

7.权利要求6所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于它包含如下步骤：

(1)二氨基丁酸-2-酮戊二酸转氨酶的基因dabat扩增：

根据GeneBank公布的Streptomyces coelicolor A3(2)的基因组序列，设计如下一对引物：

引物1：5’-CCGGAATTCATGACCATCACCCAGCCCGA-3’

引物2：5’-CCCAAGCTTTCAGGCGCAGTCGCGCACCG-3’

在上述引物的5’端的下划线部分分别引入EcoR I和Hind III酶切位点，以小白链霉菌PD-1(Streptomyces albulus PD-1，CCTCC NO：M2011043)总DNA为模板，进行PCR扩增，PCR反应物组成如下：25μl体系，2.5μl 10×Ex Taq Buffer，2μl dNTP，2.5μl MgCl₂，2μl DMSO，2μl模板，引物1和引物2各2μl，0.5μl Ex Taq，9.5μl ddH₂O，PCR反应程序为：95℃变性5min，然后94℃30s，58℃60s，72℃90s，共30个循环，72℃延续10min；将PCR产物克隆测序；

(2)重组表达质粒pET-dabat的构建：

将步骤(1)得到PCR产物纯化后用限制性内切酶EcoR I和Hind III酶切，与经过同样双酶切的质粒pET-28a(+)，在T4连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pET-dabat；

(3)将该重组质粒pET-dabat转化至宿主细胞中：

将重组质粒pET-dabat转化至感受态大肠杆菌BL21(DE3)中，涂布含有25μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上，37℃培养18～24h得到初步阳性克隆；

(4)经抗性培养基筛选得到阳性克隆：

分别挑取初步阳性克隆于5mL含有25μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，200rpm培养过夜，提取质粒，经限制性内切酶EcoRI和Hind III酶切质粒，根据电泳结果判断具有序列表SEQ ID NO：1的DNA片段的质粒为重组质粒pET-dabat，具有该质粒的菌落为阳性克隆，即为基因工程菌。

8.权利要求6所述的基因工程菌在发酵生产L-2，4二氨基丁酸中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于将基因工程菌在含有25μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中30～40℃液体培养8-20h，按2～10％(v/v)的接种量转接至发酵培养基培养5～7h后，加入终浓度为0.2～1mmol/L的乳糖诱导，降温至25～30℃再诱导培养12～20h。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于所述的发酵培养基包含如下组分：葡萄糖10～50g/L，(NH₄)₂SO₄ 5～10g/L，NaCl 5～10g/L，KH₂PO₄ 1～3g/L，MgSO₄ 0.1～1g/L，溶剂为水。